SSOs演替用于PMI推断的法医学研究

摘要

背景:
　　死亡时间(postmortem interval，PMI)推断一直是法医工作的研究重点和热点，腐败尸体的PMI推断更是法医学实践中的难题。微生物在尸体腐败过程中的作用越来越引起法医学者的重视。尸体腐解的原因是昆虫和微生物共同作用的结果。尤其在机体死亡至昆虫接触尸体之前的时间间隔里，尸体的腐败分解更是由微生物主导完成的。微生物中能产生腐败代谢产物的细菌通常称为特定腐败微生物（specific spoilage organisms，SSOs）。已有研究表明腐败过程也是SSOs相互作用和演替的过程，为研究尸体上SSOs的演替规律进行PMI推断的法医学研究提供了理论和实践基础。
　　目的:
　　在隔离昆虫和未隔离昆虫两种不同的环境下，调查大鼠尸体上SSOs的演替规律，对比大鼠尸体上口腔、眼周、阴道不同部位SSOs种类差异，分析不同PMI的SSOs种类及数量变化规律，寻找具有PMI推断价值的优势SSOs，探索利用SSOs演替规律进行PMI推断的程序和方法。并对人尸体SSOs演替规律进行PMI推断的初步探索。
　　方法:
　　运用Miseq高通量测序技术，研究PMI=0h，24h，216h时的大鼠尸体口腔SSOs，初步筛选可规律性演替的菌群。基于该筛选结果，通过细菌常规生化鉴定法及16S rDNA分子鉴定法双向验证，对比研究大鼠尸体不同部位相关时间点SSOs种类变化规律;应用细菌分析仪进行菌种半定量计数，进一步验证不同PMI有规律演替的菌群。并收集调查明确PMI的成人尸体上菌种的分布情况，探索利用SSOs演替规律对人尸体PMI推断的新途径。
　　结果:
　　Miseq高通量测序结果在生物分类学种水平上共获得81个种的SSOs，其中链球菌和巴斯德菌在口腔SSOs结构中占主要地位，分别在每个组中占25％以上的序列数。尸体腐化24h后，大部分SSOs呈现递减和消失趋势，而八叠球菌属及葡萄球菌属呈递增的趋势并成为优势菌，SSOs多样性显著降低。通过常规生化鉴定法对SSOs菌种初步定性与定量并通过16S rDNA分子鉴定双向验证，获取了隔离昆虫和未隔离昆虫两种不同的环境下，大鼠尸体口腔、眼周和阴道三个不同部位，PMI=0h，24h，216h各个确定时间点上SSOs的详细演替资料，共发现7个科（真菌，放线菌，假单胞菌，杆菌，肠杆菌，放线菌，葡萄球菌），并细分为38个种。成人尸体上共发现了8个科30个种的SSOs，种类和数量均要低于健康成人，成人和大鼠尸体之间的SSOs分布规律有着很多的相似性。
　　结论:
　　本研究发现通过Miseq高通量测序，对比分析PMI=0h的样本M1，PMI=24h的样本M2以及PMI=216h的样本M3发现，大鼠尸体在24h内口腔SSOs多样性显著降低，少数优势菌群如肺炎链球菌(Streptococcus_sp.)和侵肺巴斯德菌(Pasteurella_pneumotropica)等凸显。而在尸体晚期PMIM3阶段出现的优势菌属为八叠球菌属(Sporosarcina)及葡萄球菌属(Staphylococcus)。在尸体各部位SSOs演替过程中猪链球菌(Streptococcus suis(Ⅰ))、解乳糖奈瑟菌(Neisserialactamica)及粪肠球菌(Enterococcus faecalis)演替规律凸显。大肠杆菌（Escherichia coli）和奇异变形杆菌(proteus mirabilis)在尸体腐解过程中表现出明显的演替规律性和特异性，并初步建立了昆虫活动与细菌行为在PMI推断上的交汇点。人和大鼠的尸体之间的细菌演替规律有着很多的相似性，进一步证实在一定自然环境条件了所得结论具有一定的普适性。

目录

声明

摘要

符号说明

1 前言

2 材料与方法

2．1 主要实验试剂和仪器

2．1．1 主要实验试剂

2．1．2 主要自制试剂

2．1．3 主要实验仪器

2．2 Miseq测序分析，初步筛选目标SSOs

2．2．1 测序样本

2．2．2 Miseq测序实验流程

2．3 大鼠尸体SSOs鉴定

2．3．1 实验对象

2．3．2 实验地点

2．3．3 实验过程[18-22]

2．4 死亡早期成人尸体SSOs鉴定

2．4．1 实验对象

2．4．2 实验地点

2．4．3 实验过程

3 结果

3．1 技术路线图

3．2 Miseq测序分析

3．2．1 多样性指数分析(Alpha-diversity)

3．2．2 群落结构组分图

3．2．3 菌落组成演替分析

3．3 SD大鼠尸体外观演替

3．4 SD大鼠细菌演替规律

3．4．1 SD大鼠尸体细菌概况

3．4．2 SD大鼠尸体口腔SSOs演替规律凸显的菌种

3．4．3 SD大鼠尸体眼周演替规律凸显的菌种

3．4．4 SD大鼠尸体阴道演替规律凸显的菌种

3．4．3 SD大鼠尸体不同部位演替规律相似的菌种

3．5 死亡早期成人尸体与SD大鼠不同部位SSOs分布

4 讨论

5 结论

参考文献

综述 Daubert规则引发法医昆虫学的思考

致谢

在读期间发表论文情况