基于BAC的同源重组抗性基因的改造及BAC-EBV感染细胞系的建立

摘要

EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)与多种人类肿瘤如鼻咽癌和Burrkitt淋巴瘤相关。由于EBV全基因组有172kb，不利于基因的操作。在实验中，为了解决这一问题，细菌人工染色体(Bacterial ArtificialChromosome，BAC)中的F因子被引入到EBV的基因组。F因子能够让大基因组在细菌中的复制受到严格控制并保持低水平拷贝（1个拷贝）。基于BAC的EBV基因组能够随着BAC的复制而精确复制，并能对基因进行操作。另一方面，在体外实验中，由于上皮细胞缺少受体CR2，EBV不能感染上皮细胞，而且，EBV在其相关的鼻咽癌细胞系的传代中容易丢失.因此，在体外，难以建立EBV感染的鼻咽癌上皮细胞模型。这是EBV在EBV相关性鼻咽癌的相关研究中的一个难题。
　　在本研究中，通过EBV早期基因BZLF1和BALF4表达载体共转染细胞293HEK/p2089细胞（本课题组前期利用基于BAC的EBV基因组，BAC-EBV，构建的稳定细胞系），诱导293HEK/p2089产生EB病毒颗粒，其带有用于真核细胞筛选的潮霉素抗性基因(hyg)。这些EB病毒颗粒经细胞与细胞接触感染的方法，在B淋巴细胞的介导下，感染EBV阴性的鼻咽癌上皮细胞系。通过GFP可视化观察与RT-PCR检测EBV基因LMP1和LMP2的结果，表明，在本室成功建立EBV体外感染鼻咽癌上皮细胞系的方法。但是，鼻咽癌上皮细胞对潮霉素敏感性强，难以建立稳定的细胞系。因此，本研究设计了基于BAC的EBV基因组(BAC-EBV)，将原有的潮霉素抗性基因修改为嘌呤霉素抗性基因(pac)。在载体pcDNA3.1(+)上，将两端含有重组蛋白FLP识别位点(FRT)的卡那霉素抗性基因(kan)与pac基因进行连接，两端同时含有20bp与潮霉素抗性基因两端同源的同源臂序列。连接后，通过常规的PCR和克隆方法，两次延长两端同源臂，使kan-pac两端同源臂序列达到89bp。该同源臂延长后的线性片段通过PCR扩增，经电转化、由λ噬菌体中redαβγ系统介导在E.coli中发生同源重组(ET克隆)，从而用kan-pac替代了BAC-EBV(p2089)中相应的hyg基因。然后通过重组蛋白FLP对FRT-kan-FRT特异性的识别，切除了引入的kan基因，留下69bp的FRT“疤痕”。利用相同的方法，将前期工作中已经在BAC-EBV基础上切除EBV基因组的空白对照质粒pM-BAC中潮霉素抗性基因修改为嘌呤霉素基因。通过抗性筛选、对菌液进行PCR扩增、测序以及酶切的实验方法鉴定抗性基因修改，结果表明，成功构建质粒BAC-EBV/pac与pM-BAC/pac。在此基础上，将BAC-EBV/pac与pM-BAC/pac，转染至293HEK细胞，建立EBV感染的上皮细胞系及相应的空白对照细胞系。本研究为在EBV相关的鼻咽癌研究中细胞模型的建立打下了基础。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

第一章 前言

第二章 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 细胞系

2．1．2 质粒与菌株

2．1．3 试剂

2．1．4 引物设计

2．1．5 实验仪器

2．2 方法

2．2．1 同源重组

2．2．2 抽提质粒

2．2．3 BAC-EBV／pac、pM-BAC／pac转染293HEK细胞，并进行嘌呤霉素的筛选

2．2．4 利用“转移感染"法，使EBV感染鼻咽癌上皮细胞系

2．2．5 RT-PCR

第三章 结果

3．1 BAC-EBV以及pM-BAC(空白对照质粒)的抗性修改

3．1．1 BAC-EBV抗性基因的修改

3．1．2 pM-BAC(空白对照质粒)的抗性修改

3．2 293HEK／BAC-EBV／pac与293HEK／pM-BAC／pac细胞系的建立

3．3 EBV“转移感染”鼻咽癌上皮细胞系

第四章 讨论

第五章 结论

参考文献

综述 EBV侵入宿主细胞机制的研究进展

攻读硕士期间主要研究成果

致谢