人骨髓间充质干细胞体外培养及向感觉神经元诱导研究

摘要

第一章人骨髓间充质干细胞体外分离培养及鉴定
　　目的:
　　建立本实验室稳定分离扩增hBMSCs的方案并评估获取的细胞是否为hBMSCs，为后续实验奠定基础。
　　方法:
　　采用直接贴壁法和密度梯度离心法同时分离hBMSCs，比较原代培养过程中集落出现时间、集落数目、P3代细胞生长曲线;利用流式细胞术检测P3代细胞表面抗原CD34、CD44、CD45的表达情况;成骨、成脂诱导液诱导所获得细胞向成骨细胞、脂肪细胞分化，以茜素红及油红O染色法鉴定成骨分化中钙结节及成脂分化中脂滴的形成。
　　结果:
　　直接贴壁法和密度梯度离心法均能分离得到hBMSCs。直接贴壁法集落出现时间较密度梯度离心法短，集落数目多于密度梯度离心法，细胞增殖能力强于密度梯度离心法;流式细胞术检测直接贴壁法获得的P3代细胞CD34阳性率2.18％，CD44阳性率98.14％，CD45阳性率0.41％。成骨诱导后以茜素红染色可见钙结节，成脂诱导后油红O染色可见脂滴形成。
　　结论:
　　1、直接贴壁法和密度梯度离心法均能分离得到hBMSCs;
　　2、综合比较集落出现时间、集落数目、细胞增殖能力，直接贴壁法优于密度梯度离心法;
　　3、经鉴定分离得到的为hBMSCs，为后续实验提供了稳定的细胞来源。
　　第二章人骨髓间充质干细胞体外诱导向感觉神经元样细胞分化可行性探讨
　　目的:
　　探讨人骨髓间充质干细胞向感觉神经元诱导的可能性。
　　方法:
　　RT-PCR检测RA、Shh、Wnt信号通路相关RARα、RARβ、RARγ、PTCH1、Smoothened、Gli1、Gli2、Gli3、Frizzled、β-catenin在获得的hBMSCs中表达情况;
　　使用RA、Shh、Wnt1、RA+Shh、RA+Wnt1、Shh+Wnt1、RA+Shh+Wnt1共7组进行感觉神经元诱导，观察诱导后细胞形态改变，荧光定量PCR检测神经元相关基因β-tubulin3、MAP-2、Tau、GATA-3、Calretinin、Brn3a在各诱导组及hBMSCs中表达情况，免疫荧光检测诱导后感觉神经元相关标志GATA-3、Calretinin、Brn3a在各诱导组中表达情况，比较各组之间差异。
　　结果:
　　RARα、RARβ、RARγ、PTCH1、Smoothened、Gli1、Gli2、Gli3、Frizzled、β-catenin在hBMSCs中存在不同程度表达;各诱导组中均可获得神经元样细胞，免疫荧光显示RA+Shh组、RA+Shh+Wnt1组中可见GATA3、Calretinin阳性细胞，Wnt1组、RA+Wnt1组、Shh+Wnt1组、RA+Shh+Wnt1组中可Brn3a阳性细胞;荧光定量PCR结果示β-tubulin3、MAP-2、Tau在各诱导组中均较未诱导组表达上调，有显著性差异，各诱导组之间相对表达量无明显差别。GATA3在RA+Shh组、RA+Shh+Wnt1组中较未诱导组增高倍数较大，分别为24.4倍、68.1倍，两组与未诱导组具有统计学差异，RA+Shh+Wnt1组与RA+Shh组相比具有统计学差异。Calretinin在RA+Shh组、RA+Shh+Wnt1组中较未诱导组增高倍数较大，分别为339.2倍、572.9倍，两组与未诱导组具有统计学差异，RA+Shh+Wnt1组与RA+Shh组相比具有统计学差异。Brn3a在Wnt1、RA+Wnt1、Shh+Wnt1、RA+Shh+Wnt1组较未诱导组均有显著性差异，分别增高143.0倍、94.2倍、132.3倍、424.3倍。
　　结论:
　　1、培养的hBMSCs中存在RA、Shh、Wnt作用基础;
　　2、Shh和RA单独诱导hBMSCs无法获得GATA3、Calretinin阳性表达神经元样细胞，Shh和RA联合诱导hBMSCs可获得GATA3、Calretinin阳性表达神经元样细胞，但不能获得Brn3a阳性细胞。Wnt1单独诱导hBMSCs可获得Brn3a阳性表达神经元样细胞。RA+Shh+Wnt1组在各诱导组中具有最佳诱导效果，可获得GATA3、Calretinin、Brn3a阳性表达的感觉神经元样细胞。

目录

声明

论文说明

摘要

英文缩略词

前言

第一章 人骨髓间充质干细胞体外分离培养及鉴定

1．1 引言

1．2 实验材料与试剂

1．2．1 材料

1．2．2 主要实验仪器及耗材

1．2．3 主要试剂

1．2．4 主要试剂的配制及保存

1．3 实验方法

1．3．1 hBMSCs的分离、纯化、扩增、传代、冻存、复苏

1．3．2 hBMSCs的鉴定

1．4 实验结果与分析

1．4．1 倒置显微镜下形态变化

1．4．2 流式细胞鉴定

1．4．3 成骨诱导

1．4．4 成脂诱导

1．5 讨论

1．5．1 人骨髓间充质干细胞分离培养

1．5．2 人骨髓间充质干细胞鉴定

结论

第二章 体外诱导人骨髓间充质干细胞向感觉神经元样细胞分化可行性探讨

2．1 引言

2．2 实验材料与试剂

2．2．1 主要仪器

2．2．2 试剂

2．2．3 试剂盒

2．3 实验方法

2．3．1 RT-PCR检测hBMSCs RA、Shh、Wnt作用基础

2．3．2 感觉神经元诱导探讨

2．3．3 感觉神经元诱导后检测

2．3．4 统计学分析

2．4 实验结果与分析

2．4．1 RT-PCR检测hBMSCs RA、Shh、Wnt作用基础

2．4．2 感觉神经元诱导及检测

2．5 讨论

结论

全文结论

参考文献

综述 间充质干细胞分化为感觉神经元及间充质干细胞治疗感音神经耳聋研究现状

致谢