过量碘对线虫生长发育影响的遗传学研究

摘要

碘是生物体必需的一种微量元素，在高等动物中主要用于合成甲状腺激素，调节代谢。碘缺乏和过量都会导致严重的后果，碘缺乏是甲状腺功能低下和智力发育迟钝的一个主要原因，而碘过量是高碘性甲状腺肿、甲状腺功能亢进等诸多甲状腺疾病的主要风险因素。然而，碘过量致病的分子机制尚不明了。相对哺乳动物，碘在其他动物上的研究也很少，秀丽线虫（Caenorhabditis elegans）是一种常用的、重要的模式动物，而碘在秀丽线虫上几乎没有研究。
　　目的:研究过量碘对秀丽线虫生长发育的影响，了解线虫应对过量碘的基因及分子机制。
　　方法:在线虫培养基中加入不同浓度的碘，培养野生型线虫N2，观察过量碘对线虫生长发育的影响。通过EMS（ethyl methanesulfonate）正向遗传筛选获得相关突变体，利用SNP(single nucleotide polymorphism)遗传作图分析定位突变所在染色体及区间位置，并克隆突变基因。用DCF-DA(2'，7'-Dichlorodihydrofluorescein diacetate)对不同品系线虫体内活性氧族(reactive oxygen species,ROS)水平进行检测。
　　结果:我们在线虫培养基里加入不同浓度的碘化钠，发现野生型线虫呈现一种碘浓度依赖的负相关生长模式，当浓度达到5mM及以上时，线虫会停滞在L1到L2幼虫期。
　　我们用化学诱变剂EMS诱变野生型线虫，在10000个F2的筛选中，最终得到了12个能在5mM碘离子盘中存活的独立突变，可能影响四个基因。目前我们已经克隆了两个基因:bli-3和tsp-15，其中bli-3编码线虫的同源双重氧化酶(dual oxidase)，tsp-15编码一个和BLI-3相互作用的四次跨膜蛋白。RNAi实验表明双重氧化酶成熟因子DOXA-1（dual oxidase maturation factor 1）也参与高碘浓度导致线虫发育停滞的效应。
　　我们对L1线虫体内氧化自由基水平进行检测，发现用碘处理后线虫ROS有所升高，而bli-3及tsp-15的突变则会抑制这种ROS的升高。
　　结论:
　　1、过量碘离子导致野生型线虫N2停滞在幼虫期;
　　2、BLI-3/TSP-15/DOXA-1双重氧化酶复合体功能缺失后可抑制过量碘导致的线虫停滞效应。
　　3、过量碘通过BLI-3/TSP-15/DOXA-1双重氧化酶复合体促使线虫体内ROS合成。

目录

声明

摘要

英文缩写词表

前言

第一章 过量碘对线虫的生物学影响

1．1 实验材料与试剂

1．1．1 主要实验仪器

1．1．2 主要实验试剂与耗材

1．1．3 主要试剂配制

1．1．4 主要线虫品系

1．2 实验方法

1．2．1 配制线虫培养盘(NGM)

1．2．2 线虫存活实验

1．2．3 加热杀死大肠杆菌

1．3 实验结果

1．3．1 过量碘化钠导致线虫的生长发育停滞

1．3．2 过量碘化钠引起的线虫停滞与碘离子有关

1．4 分析及讨论

第二章 正向遗传筛选及相关基因克隆

2．1 实验材料与试剂

2．1．1 主要实验仪器

2．1．2 主要实验试剂

2．1．3 主要试剂配制

2．1．4 主要线虫品系

2．2 实验方法

2．2．1 EMS诱变策略

2．2．2 互补实验

2．2．3 bli-3及tsp-15基因测序

2．2．4 单核苷酸多态性的遗传作图

2．2．5 RNA干扰

2．2．6 RNA干扰质粒构建及转化

2．3 实验结果

2．3．1 正向遗传筛选及互补组

2．3．2 bli-3和tsp-15的克隆

2．3．3 SNP遗传作图结果

2．3．4 RNA干扰线虫在高浓度碘离子盘上存活情况

2．4 分析及讨论

第三章 突变体表型分析及相关机制研究

3．1 实验材料与试剂

3．1．1 主要实验仪器

3．1．2 主要实验试剂

3．1．3 主要试剂配制

3．1．4 主要线虫品系

3．2 实验方法

3．2．1 Hoechst 33258染色

3．2．2 氧化自由基水平(ROS)检测

3．3 实验结果

3．3．1 Hoechst 33258染色结果

3．3．2 ROS水平检测

3．4 分析及讨论

结论

参考文献

综述 碘与甲状腺的关系研究

攻读学位期间主要研究成果

致谢