脆性X智力低下基因1 mRNA 3' UTR结合蛋白的筛选与鉴定

摘要

目的及意义:脆性X综合征(Fragile X syndrome, FXS)是最常见的遗传性智力低下疾病之一,其发病率男性约为1/4000,女性约为1/6000。脆性X综合征是由其致病基因FMR1(脆性X智力低下基因1)中5′端非编码区 CGG三核苷酸重复序列不稳定扩增及CpG岛异常甲基化导致,这种CGG三核苷酸重复序列不稳定扩增及异常甲基化会导致FMR1基因的表达缺失,但是其具体的表达调控机制尚不清楚。本研究利用酵母三杂交技术从人胎脑文库中筛选与FMR1基因mRNA3' UTR有相互作用的蛋白质,并对候选蛋白进行初步鉴定分析,为脆性X综合征发病机制的研究提供新的线索。
　　内容和方法:1)将FMR1基因mRNA3'UTR序列克隆到RNA-Protein Hybrid Hunter酵母三杂交系统pRH3'质粒中,构建FMR1基因mRNA3'UTR的Bait质粒,再将Bait质粒转染酵母菌L40-ura3/pHybLex/Zeo-MS2,并检测毒性和自激活性;2)应用酵母三杂交系统,从人胎脑cDNA文库中筛选FMR1 mRNA3' UTR的相互作用蛋白,得到His+和LacZ+阳性克隆,并用酶切鉴定其外源性片断;3)共转化法将获得的阳性质粒与诱饵质粒一对一重新转入酵母菌内,对RNA-蛋白质作用进行验证;4)对验证后的阳性克隆的外源性片断进行测序及同源性分析。
　　结果:1)构建了FMR1基因mRNA3’UTR的Bait质粒,通过酶切分析及测序鉴定该bait质粒,并通过检测证实其对酵母细胞无毒性、无自激活性;2)以构建好的FMR1 mRNA3’ UTR的Bait质粒作“诱饵”,从胎脑cDNA文库中筛选得到62个His+和LacZ+阳性克隆。提取质粒扩增后酶切鉴定获得有外源性片断的质粒50个;4)将初步获得的阳性质粒与诱饵质粒一对一重新转入酵母体内,对相互作用进行验证,共获得阳性克隆20个;5)对阳性克隆测序并进行同源性分析,获得阅读框正确的候选基因序列2个:homo sapiens hypothetical protein MGC45441(人类假想蛋白 MGC45441), homo sapiens tubulin, alpha, ubiquitous protein(K-ALPHA-1,人类微管α蛋白链)。
　　结论及意义:1)建立了酵母三杂交进行RNA-蛋白质相互作用的研究平台;2)成功构建FMR1基因mRNA3' UTR的Bait质粒;3)筛选并鉴定出2个不同的基因,其编码蛋白可能与FMR1基因mRNA3' UTR相互作用,为脆性X综合征的发病机理的研究提供了新的线索。

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前言

1 材料及试剂

1.1 菌株及质粒

1.2 人胎脑文库

1.3 试剂

1.4 引物

1.5 仪器

2 实验方法

2.1 表型检测及自激活性检测

2.2 Carrier DNA 的制备

2.3 bait 质粒的构建及毒性和自激活性的检测

2.4 序列转化法筛选文库

2.5 共转化法一对一初步鉴定

2.6 阳性目的蛋白表达质粒的酵母回转验证实验：

2.7 测序及同源性分析和结构域分析

3 实验结果

3.1 宿主菌的表型验证

3.2 bait 质粒的构建及毒性和自激活性的检测

3.3 序列转化法筛选文库

3.4 共转化法一对一初步鉴定

3.5 相互作用蛋白的测序结果及同源性分析和结构域分析

4 讨论

4.1 关于酵母三杂交系统方法学上的讨论

4.2 对于结果的初步讨论

参考文献

5 结论

酵母三杂交系统的研究进展

附录

硕士期间发表论文情况

致谢