实验性变应性脑脊髓炎小鼠模型的构建及其致病机制的初步研究

摘要

目的：建立实验性变应性脑脊髓炎（Experimental allergic encephalomyelitis, EAE）小鼠模型，流式细胞仪检测实验组小鼠脾脏CD4+ T和CD4+CD25+ T细胞数量的变化，来研究CD4+ T细胞和CD4+CD25+ Treg细胞在EAE发病机制中的作用，为进一步研究其发病机制及治疗方法提供依据。 方法：用髓鞘碱性蛋白（Myelin basic protein, MBP）加福氏完全佐剂制备抗原佐剂乳化物，分别于0d、7d免疫诱导BALB/c小鼠。模型组分高剂量组与低剂量组。高剂量组每只0.2ml抗原佐剂乳化物，含400μg MBP、百日咳疫苗（Bacilus pertusis vaccine，BPV）0.1ml；低剂量组每只0.2ml抗原佐剂乳化物，含200μg MBP、BPV 0.1ml；对照组PBS +CFA+BPV抗原佐剂乳化物0.3ml，正常组不作任何处理。观察和比较各免疫组小鼠的体重变化、发病临床表现并进行症状分级评分。在二次免疫后取症状明显的模型组、对照组及正常组小鼠的脑组织进行切片和HE染色。观察比较各免疫组小鼠的组织病理变化，分析不同剂量抗原诱导小鼠发病情况。无菌分离小鼠脾淋巴细胞，经非特异性抗原植物血凝素（PHA）刺激后，ELISA方法检测脾细胞培养上清中干扰素-γ(IFN-γ)的水平。ELISA方法检测自身抗体水平。取小鼠脾脏制备单个脾细胞悬液，分别加入10μl 单克隆抗体，孵育后用流式细胞仪检测模型动物脾细胞中CD4+ T细胞和CD4+CD25+ T 细胞数目。无菌取小鼠尾部血清，检测特异性自身抗体水平。 结果：多数实验组小鼠出现 EAE的临床症状。实验组小鼠最早于抗原诱导后第三天开始出现动作迟缓，尾部无力等症状。第二次免疫后逐渐出现进食减少，行动缓慢，弓背，后肢或前肢中度无力，跛行甚至后肢完全瘫痪等症状，发病严重者死亡。其中高剂量组小鼠有9只出现尾部无力（1级），3只出现后肢或前肢中度无力（2级），1只后肢严重无力，跛行（3级），3只死亡（5级），发病率为89％。低剂量组小鼠8只出现尾部无力（1级），2只出现后肢或前肢中度无力（2级），1只死亡（5级），发病率为61％。对照组小鼠没有发病。光镜下见实验组小鼠脑组织血管周围炎性细胞浸润，呈“袖套”样改变，脑组织疏松化，对照组小鼠脑组织未见明显病理改变。EAE组的IFN-γ的水平明显高于对照组（P<0.05）。CD4+ T 细胞数目明显上升，CD4+CD25+ T细胞数目变化不明显。模型组抗体水平明显高于对照组（P<0.01）。 结论： （1）本研究采用免疫诱导法所建立的 BALB/c 小鼠 EAE 动物模型在临床表现、病理变化等方面均符合 EAE 改变，模型稳定、可靠。 （2）实验动物IFN-γ水平增高，可能是导致自身反应性Th1细胞升高的原因之一。CD4+ T 细胞增殖，CD4+CD25+ Treg与CD4+ T细胞比值改变和CD4+CD25+ Treg 细胞相对下降可能是EAE的致病机制之一。