大豆细胞质雄性不育系与保持系线粒体DNA的RAPD分子标记

摘要

随着分子生物学的发展，有关细胞质雄性不育(cytoplasmicmalestdrility，CMS)机理的研究取得了大量进展。在玉米、矮牵牛、水稻、小麦、油菜、向日葵和菜豆等不育胞质的线粒体基因组上已找到了可能与CMS有关的基因座位。同其它作物相比，大豆CMS的研究进展缓慢。自1993年吉林省农科院孙寰等发现世界上第一个大豆细胞质雄性不育系以来，该领域的研究和应用取得了可喜的进展，但是对其分子机理的研究报道尚属空白。 本实验以栽培大豆的三对不育系和保持系材料(JLCMS1-1A、JLCMS1-1B、JLCMS1-2A、JLCMS1-2B、JLCMS1-3A、JLCMS1-3B)为研究对象(成对材料间为严格的同核异质材料)，通过随机扩增多态DNA(RandomlyAmplifiedPolymorphicDNA，RAPD)技术，对大豆不育系与保持系线粒体基因组进行扩增，旨在探讨大豆不育系与保持系线粒体基因组间的差异，为大豆细胞质雄性不育相关基因的分离鉴定打下基础，并为揭示大豆细胞质雄性不育(CMS)的分子机制提供理论依据。 对大豆线粒体基因组进行RAPD分析，模板DNA的质量要高，即不能含有蛋白质或核DNA等的污染。参考其它作物线粒体DNA的提取方法，经改进后，所提取的大豆线粒体DNA样品经琼脂糖凝胶电泳分析、OD值测定，结果表明其得率和纯度可以满足PCR扩增；酶切分析和线粒体特异引物的扩增结果显示，线粒体DNA不含有核DNA的污染。 本研究首先建立了稳定、高效的RAPD反应体系，然后利用OPERON公司的400个随机单引物(OPA-OPT系列)和14组双引物对供试材料进行扩增，大部分引物均有清晰稳定的扩增产物。RAPD反应体系具体参数如下：dNTPs浓度为0.1mmol/L；Taq酶用量为2U；模板DNA浓度为0.4ng/μL；引物浓度为0.8ng/μL。 RAPD分析中，有些特异带只出现在不育系上，而在保持系相应的位置上没有。如引物OPE01、OPH07、OPI12、OPK04、OPP17、OPN03、OPD02和OPD20仅在不育系上出现特异带。植物的线粒体基因组容易因DNA片段的插入、缺失或重组而引起控制花粉可育功能的基因发生突变，从而使育性发生改变。这些特异扩增的片段只出现在不育系上，说明不育系的线粒体基因组可能比保持系的线粒体基因组多出某段序列或发生了基因重组而引起基因组织结构的改变，并最终引起大豆细胞质雄性不育。 相反，有16个引物(OPA12、OPB06、OPD11、OPD18、OPH18、OPI06、OPI09、OPK07、OPL05、OPL10、OPL13、OPM06、OPP09、OPP15、OPQ13、OPR03)仅在保持系上获得了一条或多条特异扩增片段，说明不育系的线粒体基因组比保持系的线粒体基因组缺少某段序列使差异产生。这种仅出现在保持系上的特异片段在数量上要多于出现在不育系上的特异片段数量。可能反映了长期进化过程中，保持系线粒体DNA具有很强的保守性，而不育系线粒体DNA在核质互作申容易受到内在或外在因素的影响，导致序列发生变化，进而失去与同一引物较多的结合机会。菜豆中，与不育相关的线粒体基因pvs就是在不育系中缺失导致不育产生的。因此，在大豆RAPD分析中出现在保持系上的特异扩增条带对细胞质雄性不育的研究具有重大的价值。 在双引物扩增中，14组双引物的RAPD实验结果与对应的两个单引物扩增结果，只有4组(OPF03/OPF06，OPB20/OPI14，OPG13/OPP17，OPG13/OPD18)是完全一致的，其余10组与原来的单引物扩增结果均有差异。说明RAPD双引物扩增揭示出了单引物所检测不到的多态性，双引物扩增实验可以作为单引物扩增的丰富和补充。 另外，本实验中所涉及到的在供试材料间存在差异的引物，有一部分(OPA12、OPH18、OPI09、OPH07)在其它作物(油菜、大白菜)不育基因的研究中也存在多态性标记，这暗示着植物细胞质雄性不育在分子基础上可能存在一些共性。 本研究证明，应用RAPD技术可以快速、高效地检测线粒体DNA在不育系和保持系之间的遗传多态性，在分子水平上揭示CMS的形成机制。通过RAPD方法研究大豆线粒体DNA，初步筛选到一些可能与细胞质雄性不育有关的线粒体DNA分子标记。针对所获得的部分差异片段，我们正在进行进一步的验证实验。将这些差异片段回收，克隆，测序，并分析基因的序列结构与功能，进一步确定哪些片段与不育相关，从而为在分子水平上研究大豆细胞质雄性不育的机理奠定基础。

目录

文摘

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第一章绪论

1.1引言

1.2植物雄性不育概述

1.2.1植物雄性不育的概念与分类

1.2.2细胞质雄性不育的现象及意义

1.3大豆细胞质雄性不育研究进展

1.4高等植物的线粒体基因组

1.4.1线粒体基因组的特点

1.4.2线粒体基因组与细胞质雄性不育的关系

1.5分子标记概述

1.5.1分子标记的概念

1.5.2分子标记的种类

1.5.3研究mtDNA与CMS关系的常用策略

1.5.4关于RAPD技术

第二章大豆线粒体DNA的RAPD研究

2.1实验材料

2.1.1生物材料

2.1.2引物和试剂

2.1.3主要仪器设备

2.1.4主要缓冲液组成

2.2大豆线粒体DNA的提取与分析

2.2.1大豆黄化苗的培育

2.2.2大豆线粒体的分离和纯化

2.2.3大豆线粒体DNA的提取

2.2.4大豆线粒体DNA的电泳检测

2.2.5紫外分光光度法测定大豆线粒体DNA含量

2.2.6大豆线粒体DNA的酶切分析

2.2.7大豆线粒体DNA特异引物的PCR扩增

2.3大豆线粒体DNA的RAPD标记

2.3.1 RAPD实验体系的优化

2.3.2 RAPD单引物的筛选

2.2.3 RAPD双引物的筛选

第三章结果与分析

3.1大豆线粒体DNA的检测

3.1.1大豆线粒体DNA的电泳检测

3.1.2紫外分光光度法检测大豆线粒体DNA纯度

3.1.3大豆线粒体DNA的酶切分析

3.1.4大豆线粒体DNA特异引物的PCR扩增

3.2大豆线粒体DNA的RAPD标记

3.2.1 RAPD实验体系的优化

3.2.2 RAPD单引物筛选的结果

3.2.3 RAPD双引物筛选的结果

3.2.4不育系与保持系mtDNA的同源性分析

3.2.5不育系与保持系mtDNA的多态性与不育性的关系

第四章结论

第五章讨论

5.1大豆细胞质雄性不育的复杂性

5.2大豆线粒体DNA RAPD标记的应用

5.3大豆线粒体DNA的提取

5.4大豆线粒体DNA RAPD标记体系的建立

5.4.1影响RAPD的因素

5.4.2 RAPD结果的稳定性

5.4.3 RAPD扩增时易出现的问题及解决办法

附图1

附图2

图版说明

缩写表

参考文献

致谢