氨氯地平通过下调内皮细胞源PDGF-B抑制平滑肌细胞增殖与迁移

摘要

研究背景：血小板源性生长因子(PDGF)是一种重要的促细胞分裂剂，通过组织局部的特异性受体发挥作用，可以刺激多种细胞分裂和增殖。大量研究发现PDGF-B是动脉粥样硬化(As)形成过程中血管内皮细胞、血小板、单核巨噬细胞细胞和血管平滑肌细胞之间相互作用的介质，在As形成中有重要意义。课题组的早期研究发现钙通道阻滞剂(CCB)类药物具有显著的抗As作用，而这种作用可能与抑制平滑肌细胞增殖和迁移有关，但具体机制仍不清楚。 目的：观察oxLDL对人脐静脉内皮细胞PDGF-B的表达的影响以及氨氯地平对其的作用；人脐静脉内皮细胞受到oxLDL刺激后，分泌的PDGF-B对人脐动脉平滑肌细胞的增殖、迁移的影响以及氨氯地平的作用。 方法：1．不同浓度(0mg/L、25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L) oxLDL与HUVEC-12细胞孵育24h，50 mg/L oxLDL与HUVEC-12细胞孵育不同时间(Oh、3h、6h、12h、24h)后，Western blot与RT-PCR分别检测细胞PDGF-B的表达，筛选出最适的处理浓度与时间。 2．不同浓度氨氯地平(0μM、0.1μM、1.OμM、10.0μ M)预孵育HUVEC-12内皮细胞30min后，与50mg/L oxLDL共同孵育24h，Western blot与RT-PCR分别检测细胞PDGF-B的表达，ELISA检测培养上清液中PDGF-B蛋白质的表达。3.10.0μM氨氯地平和20μMPDGF-B抗体分别预孵育HUASMC30min，然后与PDGF-B上清液共同孵育24h，MTT检测细胞增殖。4．收集贴壁平滑肌细胞并计数，将2.6ml培养液加入Transwell的下室，将1.5mL密度为1×1O8个／L SMCs悬浮液，注入上室，然后在下室加入不同处理因素(n=3)。培养24h，取上室，酒精棉球擦掉上室膜上未迁移的细胞，95%酒精固定10min，苏木素染色5min，随机选择3个连续显微镜视野(10x)计数迁移到上室膜下的细胞，取平均数。 结果： 1．oxLDL在0-100mg/L的浓度范围内，随oxLDL浓度增加，PDGF-B mRNA和蛋白的表达随之上调，浓度为50mg/L时，PDGF-B mRNA和蛋白的表达达峰值，浓度为100mg/L时，表达下降。50mg/L的oxLDL与HUVEC孵育0-24h，随处理时间的延长，PDGF-BmRNA和蛋白的表达逐渐增加，在24h时，达最大值．2．不同剂量氨氯地平预孵育HUVEC-12内皮细胞30min后，与oxLDL共同孵育24h，PDGF-B的表达下降，并呈量一效关系。3.10.0μM氨氯地平和20μM PDGF-B抗体顸孵育人脐动脉平滑肌细胞30min后，与PDGF-B上清液共同孵育24h，平滑肌细胞的增殖明显降低，PDGF-B抗体单独处理细胞时，两者的表达没有明显改变。4．将人脐动脉平滑肌细胞种到transwell上室，下室中加入条件培养基。与PDGF-B组相比，10.0μM氨氯地平与20μMPDGF-B抗体组，平滑肌细胞的迁移数量明显减少。 结论： (1) oxLDL能上调人脐静脉内皮细胞PDGF-B的表达并能被氨氯地平所抑制； (2)氨氯地平通过下调内皮细胞源性PDGF-B来抑制人脐动脉平滑肌细胞的增殖与迁移。