大鼠脑缺血再灌后溶酶体Cathepsin B介导的细胞凋亡与Mkk6的关系及法舒地尔对其干预机制的研究

摘要

背景与目的
　　细胞凋亡又称程序性细胞死亡,是细胞内一个积极主动的程序性生理过程。细胞凋亡是脑缺血再灌注损伤后缺血半暗带神经细胞死亡的重要方式。凋亡有多种途径。溶酶体中的组织蛋白酶B(Cathepsin B、CB)参与了细胞凋亡,在脑缺血再灌注后神经元凋亡中发挥着重要作用。目前在大鼠脑缺血再灌注模型中有关CB介导的凋亡通路的研究较少。pMkk6是丝裂原蛋白激酶(mitogerr activated protein kinase, MAPK)级联信号途径P38通路中上游信号途径的重要蛋白。真核细胞通过该途径介导细胞外信号到细胞内反应的重要信号转导,参与机体的应激反应,发挥调节功能。本研究通过检测局灶性脑缺血再灌注损伤后CB与细胞信号通路中的P38- MAPK通路重要上游激动蛋白pMkk6之间的表达变化,以探讨CB、pMkk6在脑缺血再灌注损伤中的作用及其溶酶体途径的细胞凋亡;并且应用法舒地尔干预观察其对上述蛋白和溶酶体的影响及神经保护机制,从而为临床治疗脑缺血提供理论基础和治疗思路。
　　方法
　　10-12周龄清洁级健康雄性Sprague-Dawley大鼠141只,体重约250-300g随机分为假手术对照组(n=11)、脑缺血模型组(n=65)和法舒地尔治疗组(n=65)(干预组)。采用线栓法制备大脑中动脉闭塞(MCAO)模型,缺血2小时后恢复再灌注,干预组在脑缺血再灌注即刻用法舒地尔(8mg/kg)腹腔注射,每12h一次,其余组于同一时间点腹腔注射等量生理盐水。Longa’s的5级标准评分法评价神经功能缺损。再灌注后分别于2h、6h、12h、24h、48h处死动物。模型组和干预组每时间点取6只大鼠行TTC染色测定脑梗死体积的变化;另外6只行免疫荧光法分别检测脑缺血半暗带区CB及pMkk6蛋白表达变化,原位末端标记法检测神经细胞凋亡的变化;剩下1只大鼠行透射电镜观察溶酶体的形态学变化。
　　结果
　　1.模型成功率为76.2％,法舒地尔干预能显著减少大鼠神经功能缺损评分(P<0.05)。
　　2.正常组和假手术组均未见梗死灶,偶尔可以检测到凋亡细胞;模型组大鼠脑梗死体积及神经细胞凋亡数随再灌注后时间的延长而增加,均在48h达高峰,法舒地尔能够减轻上述损害(P<0.05)。
　　3.正常组和假手术组大鼠均可检测到一定数量的CB、pMkk6蛋白表达;模型组 CB和pMkk6蛋白表达呈动态变化,于再灌注后2h开始增高,CB蛋白表达24h达高峰,pMkk6蛋白12h达高峰;法舒地尔干预组 CB和pMkk6蛋白表达的变化趋势与模型组相似,但数量较其明显减少(P<0.05)。
　　4.电镜观察显示缺血半暗带早期的神经细胞,溶酶体体积增大,数量增多,向次级溶酶体转变,缺血后期,镜下神经细胞表现为凋亡。
　　结论
　　1.大鼠脑缺血再灌注后CB表达上调,可能通过溶酶体途径参与细胞凋亡;大鼠脑缺血再灌注后 pMkk6蛋白表达上调,可能通过参与缺血性神经损伤的凋亡信号转导途径的病理生理过程。
　　2.法舒地尔可能通过稳定溶酶体膜减少CB蛋白的释放和通过抑制凋亡信号转导途径P38/MAPK的关键上游激酶pMkk6蛋白的磷酸化及表达,而抑制神经元凋亡和起到神经元保护作用。

目录

封面

目录

中文摘要

英文摘要

第一章 前 言

第二章 材料与方法

1 主要试剂与药品

2 主要仪器

3 实验方法

第三章 结 果

1神经功能缺损评分及动物模型的成功率

2脑梗死体积的变化

3脑缺血后再灌后的神经细胞凋亡变化及比较

4免疫荧光

5电镜结果

第四章 讨 论

1 大鼠脑缺血模型的制备

2 脑缺血再灌后CathepsinB与凋亡

3 脑缺血再灌后pMKK6的表达与细胞凋亡

4 溶酶体与凋亡的关系

5 Rho激酶及Rho激酶抑制剂法舒地尔与缺血性脑卒中细胞凋亡的关系

6 展望

第五章 结 论

参考文献

附录

综述

攻读硕士学位期间发表的论文及参与的科研课题

致谢