罗格列酮和肿瘤坏死因子α对脂肪细胞线粒体生物合成及ZAG表达的影响

摘要

目的:
　　观察罗格列酮和肿瘤坏死因子α(TNF-α)对脂肪细胞线粒体生物合成和ZAG表达的影响。
　　方法:
　　体外培养3T3-L1前脂肪细胞并诱导分化为成熟脂肪细胞,分别以不同浓度的罗格列酮和TNF-α干预48h,提取总RNA,采用RT-PCR方法检测PGC-1α、TFAM、NRF-1/2及ZAG mRNA表达水平。在此实验的基础上,验证罗格列酮和TNF-α对脂肪细胞线粒体合成相关因子及ZAG表达的影响,将分化成熟的脂肪细胞随机分为四组:对照组、罗格列酮组(50μM)、TNF-α组(30ng/mL)、罗格列酮+TNF-α组(RT组),采用RT-PCR和Western Blot技术检测PGC-1α、TFAM、NRF-1/2及ZAG mRNA和蛋白表达;采用线粒体特异性染料Mito Traker Green预染成熟脂肪细胞,激光共聚焦显微镜下观察线粒体荧光强度;采用 ELISA法测定细胞培养液上清中FFA浓度。
　　结果:
　　1、罗格列酮单独干预分化成熟的3T3-L1脂肪细胞,ZAG及 PGC-1α、TFAM、NRF-1/2 mRNA表达水平均高于对照组(P<0.01);
　　2、TNF-α单独干预分化成熟的3T3-L1脂肪细胞,ZAG及PGC-1α、TFAM、NRF-2 mRNA表达水平均低于对照组(P<0.01),且以TNF-α组(100ng/mL)降低最为显著;TNF-α组(10-100ng/mL)NRF-1mRNA表达水平低于对照组(P<0.01),但TNF-α组(1ng/mL) NRF-1 mRNA表达无显著差异(P>0.05);
　　3、罗格列酮(50μM)和TNF-α(30ng/mL)干预3T3-L1脂肪细胞48h,罗格列酮组和罗格列酮+TNF-α组线粒体荧光强度高于对照组,而TNF-α组线粒体荧光强度低于对照组;
　　4、罗格列酮(50μM)和TNF-α(30ng/mL)干预3T3-L1脂肪细胞48h,罗格列酮组ZAG、PGC-1α、TFAM、NRF-1/2 mRNA表达水平均高于对照组(P<0.01);TNF-α组ZAG、PGC-1α、TFAM、NRF-1/2 mRNA表达水平均低于对照组(P<0.01);罗格列酮+TNF-α组ZAG、TFAM、NRF-2 mRNA表达水平高于对照组(P<0.01),而NRF-1mRNA表达水平低于对照组(P<0.05),PGC-1α mRNA表达差异无显著性(P>0.05);
　　5、罗格列酮(50μM)和TNF-α(30ng/mL)干预3T3-L1脂肪细胞48h,罗格列酮组ZAG、NRF-1和PGC-1α、TFAM蛋白表达水平高于对照组(分别为P<0.05, P<0.01),NRF-2蛋白表达差异无显著性(P>0.05);TNF-α组ZAG、NRF-1和TFAM、NRF-2蛋白表达水平低于对照组(分别为 P<0.05,P<0.01),PGC-1α蛋白表达著差异无显性(P>0.05);罗格列酮+TNF-α组ZAG和PGC-1α蛋白表达水平高于对照组(分别为P<0.01,P<0.05),NRF-2蛋白表达水平低于对照组(P<0.01),TFAM、NRF-1蛋白表达差异无显著性(P>0.05);
　　6、罗格列酮(50μM)和TNF-α(30ng/mL)干预3T3-L1脂肪细胞48h,罗格列酮组 FFA浓度低于对照组,TNF-α组 FFA浓度高于对照组,差异均有显著性(P<0.05),罗格列酮+TNF-α组浓度表达差异无显著性(P>0.05)。
　　结论:
　　1)罗格列酮促进脂肪细胞ZAG和PGC-1α、TFAM、NRF-1/2 mRNA表达;促进ZAG和PGC-1α、TFAM、NRF-1蛋白表达,
　　2)TNF-α减少ZAG和PGC-1α、TFAM、NRF-1/2 mRNA表达减少,ZAG和TFAM、NRF-1/2蛋白表达,
　　3)罗格列酮促进线粒体脂肪酸β氧化功能恢复,降低FFA浓度;TNF-α减弱线粒体脂肪酸β氧化功能,增加FFA浓度。

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前言

1. 实验材料

1.1 主要试剂、耗材及来源

1.2 相关试剂的配置

1.3 主要仪器

2. 实验方法

2.1 细胞培养

2.2 干预及分组

2.3 线粒体特异性染料MitoTraker Green FM染色

2.4 RT-PCR检测PGC-1α、TFAM、NRF-1/2及ZAG mRNA表达

2.5 Western Blot检测PGC-1α、TFAM、NRF-1/2及ZAG蛋白表达

2.6 ELISA法检测细胞培养上清液中FFA浓度2.6.1 ELISA法具体步骤(按说明书操作)：

2.7 统计学处理

3. 实验结果

3.1 3T3-L1前脂肪细胞分化的形态学观察

3.2 罗格列酮对PGC-1α、TFAM、NRF-1/2、ZAG mRNA表达的影响

3.3 TNF-α对PGC-1α、TFAM、NRF-1/2、ZAG mRNA表达的影响

3.4 线粒体特异性染色分析

3.5 罗格列酮和TNF-α联合干预对PGC-1α、TFAM、NRF-1/2、ZAG mRNA表达的影响

3.6 罗格列酮和TNF-α联合干预对PGC-1α、TFAM、NRF-1/2、ZAG蛋白表达的影响

3.7 游离脂肪酸(FFA)浓度测定

讨论

1. 罗格列酮与TNF-α对ZAG表达的影响

2. 罗格列酮与TNF-α对线粒体生物合成相关基因的影响

3. 罗格列酮与TNF-α对FFA浓度的影响

实验结论

参考文献

综述

参考文献

一、攻读硕士学位期间发表论文情况

二、课题资助情况

致谢