三七总皂苷对视神经节细胞谷氨酸兴奋毒性的保护作用

摘要

目的：
　　观察三七总皂苷（total panax notoginseng saponins， tPNS）对谷氨酸（glutamate，Glu）所致的视神经节细胞兴奋毒性的保护作用，并初步探讨其作用机制，从而为其用于青光眼的治疗提供理论依据。
　　方法：
　　体外培养视神经节细胞系 RGC-5，根据分组给予不同的处理。其中空白对照组加入等量培养基，Glu兴奋模型组加入1mM Glu刺激24h，阳性对照组在模型组的基础上加入10μM MK-801，观察组在 Glu基础上加入100～500μg/ml tPNS。24h后，通过钙黄绿素-乙酰甲酯染色法观察RGC-5的活性改变情况，流式细胞术检测RGC-5细胞凋亡。同时，采用RT-PCR检测细胞处理后Thy-1的表达情况，激光共聚焦法检测细胞内Ca2+的水平，Western blot检测caspase-3表达，硝酸还原酶法检测一氧化氮(nitric oxide，NO)的产生情况。
　　结果：
　　1. Calcein-AM染色结果显示， Glu作用RGC-5细胞24h后，使其活细胞数明显降低（P<0.01），而同时加入100～500μg/ml tPNS共孵育，能以剂量依赖性方式增加活细胞数。当tPNS浓度为500μg/ml时，RGC-5活细胞数比Glu组增加了112.3％；
　　2. RT-PCR结果显示，Glu处理能使Thy-1 mRNA水平降低。tPNS和MK-801干预后，Thy-1的mRNA表达水平较Glu组明显上调，且tPNS和Thy-1的表达呈一定的剂量依赖性；
　　3.流式细胞术检测结果显示，与对照组相比，Glu能明显诱导 RGC-5细胞，100～500μg/ml tPNS以及 MK-801干预后凋亡细胞减少，呈一定的剂量-效应关系；
　　4.正常对照组几乎未检测到 caspase-3的活性亚基（17-kDa），Glu处理后，17-kDa活性亚基明显增多。不同浓度tPNS处理后，caspase-3活性亚基量显著降低；
　　5. RGC-5细胞经Glu处理24h后，细胞内Ca2+浓度显著增高。当给予tPNS处理后，胞内Ca2+浓度随着tPNS剂量的增高而降低；
　　6. Glu组NO含量明显高于阴性对照组(P＜0.01)；tPNS处理后，NO含量随剂量的增加而降低。当tPNS浓度为500μg/ml时，NO含量达（0.9241±0.025）μM，与Glu组相比， P<0.05。
　　结论：
　　1．tPNS有效保护Glu兴奋所致的细胞凋亡；
　　2．tPNS对Glu兴奋毒性的细胞保护作用可能是通过抑制胞内Ca2+浓度、NO的产生以及降低caspase-3的活性而实现的。

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