TOCP对人成神经瘤SH-SY5Y细胞PKC活性及转位的影响

摘要

目的：
　　研究三邻甲苯基磷酸酯（Tri-ortho-cresyl phosphate，TOCP）同时结合应用工具药蛋白激酶C（Protein kinase C，PKC）激活剂佛波酯（phorbol12-myristate13-acetate，PMA）和PKC抑制剂星胞菌素（staurosporine，SP）处理人成神经瘤细胞SH-SY5Y不同时间后，观察细胞中PKC的活性、PKC转位及表达的影响，为解释TOCP毒害作用奠定基础，拓宽对TOCP致神经毒性的认识，而且有助于进一步理解和揭示神经退行性病变的机理具有重要的理论意义。
　　方法：
　　1.以人成神经瘤细胞系 SH-SY5Y细胞为实验材料进行培养，使用 TOCP（0，0.25，0.5，1.0 mmol/L）进行染毒，染毒时间12，24和48小时。通过普洛麦格公司的PKC活性检测试剂盒检测PKC的活性。根据PKC活性的检测结果，进一步结合使用工具药PKC激活剂PMA（0，25，100 nmol/L）和PKC抑制剂SP（100 nmol/L）作用SH-SY5Y细胞，染毒12，24和48小时后分别检测细胞内PKC的活性。
　　2．同上条件，以TOCP及工具药PMA和SP作用SH-SY5Y细胞后，间接免疫荧光技术检测 PKC在细胞内的定位，荧光倒置显微镜观察结果。
　　3．同上条件，以TOCP及工具药PMA和SP作用SH-SY5Y细胞后，Western blotting检测胞膜PKCα、PKCβI、PKCβⅡ、总PKC和总PKC磷酸化蛋白的表达。
　　结果：
　　1.0.5 mmol/L TOCP作用于SH-SY5Y细胞24小时，PKC蛋白磷酸化水平发生变化，磷酸化PKC蛋白增多；1.0 mmol/L作用细胞12小时和24小时，随着TOCP染毒时间的延长，磷酸化 PKC蛋白逐渐增多；对凝胶电泳条带进行灰度扫描并进行统计学分析，结果发现，0.5mmol/L TOCP染毒24小时以及1.0 mmol/L TOCP染毒12和24小时，细胞内磷酸化PKC/非磷酸化PKC（p-PKC/PKC）灰度比值与对照组比较有统计学意义（P<0.05），并且TOCP染毒浓度高，染毒时间长均可见p-PKC/PKC增加。提示，在实验组的染毒剂量中，1.0 mmol/L TOCP作用SH-SY5Y细胞24h诱导PKC活性最强。100 noml/L PMA作用SH-SY5Y细胞12小时，100 noml/L SP作用SH-SY5Y细胞12小时，PKC蛋白磷酸化水平发生变化，磷酸化PKC蛋白增多；100 noml/L PMA作用SH-SY5Y细胞24小时和48小时，100 noml/L SP作用SH-SY5Y细胞24小时和48小时，随着PMA作用时间的延长，磷酸化PKC蛋白逐渐增多；对凝胶电泳条带进行灰度扫描并进行统计学分析，结果发现，25noml/L PMA作用SH-SY5Y细胞24小时和48小时以及100 noml/L PMA作用SH-SY5Y细胞12、24小时和48小时，和100 noml/L SP作用SH-SY5Y细胞12小时、24小时和48小时，细胞内磷酸化PKC/非磷酸化 PKC（p-PKC/PKC）灰度比值与对照组比较有统计学意义（P<0.05），并且PMA/SP浓度越高，作用时间越长均可见p-PKC/PKC增加。提示， PMA/SP作用SH-SY5Y细胞24h和48h时诱导PKC活性较强。
　　2.在荧光倒置显微镜下，对照组SH-SY5Y细胞呈类纤维细胞样，呈不规则多边形，有不长于胞体的短突起，荧光染色强度弱。1.0 mmol/L TOCP作用SH-SY5Y细胞24小时后，细胞形状改变由梭形和多角形变成圆形，绿色荧光由细胞质向细胞膜周边转位，膜荧光强度增强。
　　3.应用100 noml/L PMA和100 noml/L SP预处理，TOCP作用SH-SY5Y细胞24小时后，TOCP与PMA共同作用，TOCP与PMA分别作用SH-SY5Y细胞24小时，PKC各种异构体蛋白表达增强。SP与TOCP共同作用和SP单独作用SH-SY5Y细胞24小时，PKC各种异构体蛋白表达下降。
　　结论：
　　1.1.0 mmol/LTOCP作用SH-SY5Y细胞24小时能激活细胞内PKC活性，并促进PKCα、βI和βⅡ的膜转位。
　　2. PKC激活剂佛波酯（PMA）和PKC抑制剂星胞菌素（SP）分别能够增强和抑制TOCP诱导的PKC激活和膜转位效应。

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主要英文缩略语索引

中文摘要

英文摘要

前言

材料与方法

1材料

1.1 细胞系及培养

1.2主要试剂

1.3主要仪器

2 实验方法

2.1 TOCP对神经细胞内PKC的活性的影响

2.2 TOCP对SH-SY5Y细胞PKC转位的影响

2.3 TOCP对神经细胞内总PKC及各亚型蛋白表达的影响

2.4 统计学分析

结果

1 TOCP对SH-SY5Y细胞内PKC活性的影响

2 TOCP对SH-SY5Y细胞PKC转位的影响

3 TOCP对神经细胞内PKC各种异构体蛋白的表达的影响

讨论

结论

参考文献

综述 三邻甲苯基磷酸酯的神经毒性研究进展

在读期间已公开发表论文和参与的科研项目

附录 主要试剂配制

致谢