pORF5质粒蛋白抑制LL37抗菌肽促进沙眼衣原体感染及机制初步研究

摘要

目的：沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis，Ct）易造成持续性感染而引发严重的并发症，但其致病机制尚不明确。已有研究表明人源性抗菌肽LL37对衣原体的感染起到一定的抑制作用。pORF5是由Ct质粒基因编码并且分泌到宿主细胞胞浆的分泌性蛋白，与衣原体致病密切相关。本研究拟探讨Ct质粒蛋白pORF5是否通过抑制 LL37促进衣原体感染，并初步探讨其分子机制，为 Ct致病机制的深入研究提供实验依据。
　　方法：将已构建好的pGEX-6p-1/pORF5重组质粒转化大肠杆菌XL1-Blue菌株，筛选pORF5重组蛋白表达菌，0.2mM IPTG诱导表达GST-pORF5融合蛋白，融合蛋白经亲和层析纯化及蛋白酶切除 GST标签，制备纯化的pORF5蛋白；SDS-PAGE和Western blotting分析和鉴定pORF5蛋白，BCA法测定pORF5蛋白浓度并用鲎试剂对内毒素进行检测；30μg/mL的pORF5和用20μg/mL的LL37单独或者共同孵育衣原体后感染HeLa细胞28h，间接免疫荧光技术检测不同处理组衣原体包涵体的形成数量、大小和形态变化；收集共孵育6h后的HeLa细胞，QPCR技术检测TNF-α的表达情况；衣原体单独或与30μg/mL的pORF5孵育后感染HeLa细胞，收集共孵育6h后的HeLa细胞，QPCR技术检测 TNF-α的表达情况；用浓度为10～30μg/mL的pORF5蛋白和浓度为20～50μg/mL的LL37单独或共同刺激HeLa细胞，28h后收集细胞，流式技术检测细胞凋亡情况。
　　结果：
　　(1) pGEX-6p-1/pORF5成功转化大肠杆菌XL1-Blue菌株，并可高效表达GST-pORF5融合蛋白，融合蛋白经蛋白酶酶切后得到高纯度的pORF5蛋白，纯度约为95％。
　　(2)当pORF5蛋白浓度为10μg/mL时细胞凋亡率为5.75%，当pORF5蛋白浓度提高到20μg/mL时细胞凋亡率为9.42%，当pORF5蛋白浓度达到30μg/mL时细胞凋亡率为17.52%， pORF5蛋白可诱导 HeLa细胞凋亡,且细胞凋亡率随pORF5蛋白浓度的升高而增加。
　　(3)间接免疫荧光检测发现 pORF5蛋白能降低 LL37对衣原体感染的抑制作用，空白对照组衣原体包涵体形成单位(inclusion-forming unit， IFU)为3.80×105/mL，20μg/mL LL37处理组IFUs为2.00×105/mL，30μg/mL pORF5处理组IFUs为3.00×105/mL，20μg/mL LL37和30μg/mL pORF5共同处理组IFUs为3.07×105/mL。pORF5蛋白单独处理组和pORF5蛋白与LL37共同处理组IFUs明显高于 LL37处理组，差异具有显著性（P<0.05）；与空白对照组相比较， pORF5蛋白单独处理组和pORF5蛋白与LL37共同处理组，IFUs无显著性差异。
　　(4)实时荧光 PCR检测发现，与LL37单独处理组相比较，pORF5蛋白和LL37共同处理组TNF-α的相对表达量增加了7.3倍，pORF5蛋白与与衣原体共同处理组与衣原体单独处理组相比，LL37的相对表达量降低了17%。
　　结论：
　　(1) pORF5质粒蛋白能明显降低LL37对衣原体感染的抑制作用。
　　(2) pORF5质粒蛋白可通过上调TNF-α、下调LL37的表达降低LL37的抑制作用，促进Ct感染。

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