荧光标记共培养实验模型的构建及其在DNA辐射损伤旁效应检测的应用

摘要

目的：
　　建立研究电离辐射诱导的细胞旁效应 DNA损伤的新的实验模型，探究γ射线及低剂量的α粒子辐射产生的旁效应DNA双链断裂（DSBs）和修复的效应特征。
　　方法：
　　构建定位于细胞胞浆中的带有红色荧光蛋白标签的pDsRed1-N1-Hspc300重组质粒，将质粒转染到人皮肤成纤维细胞（HFS）中，筛选出稳定表达的HFS-RFP-Hspc300细胞系。将其中一种细胞进行电离辐射（γ射线和低剂量的α粒子），另一种细胞作为辐射旁效应细胞，把两种细胞混合培养，在不同的时间点收集细胞，利用免疫荧光共聚焦反应，观察镜下辐照细胞和旁效应细胞的细胞核内γH2AX的foci个数，从而探究细胞辐射旁效应的DNA损伤和修复情况（主要是DNA的双链断裂损伤（DSBs））。
　　结果：
　　1．建立了HFS-RFP-Hspc300细胞和HFS细胞共培养的细胞DNA损伤辐射旁效应研究实验模型。
　　2．2Gy60Coγ射线照射细胞混合后，直接受照射的HFS细胞与旁效应细胞HFS-RFP细胞γH2AX的数目变化情况相似，均在照射后30min出现最大值，随后慢慢降低，照后各时间点与对照组比较均有显著性差异（P<0.05）。
　　3．不同低剂量的α粒子照射，直接受照细胞 HFS-RFP和旁效应细胞 HFS中的γH2AX簇集点数随时间变化的趋势相似，均在照后1h达到高峰，并且24h 时还是和0h的情况有显著性差异（P<0.05）。辐照细胞不同时间点的比较，在30min、2h、4h，不同剂量间有显著性差异（P<0.05），在1h和8h时间点出现两个H2AX foci峰值。
　　结论：
　　1．成功构建了电离辐射细胞DNA损伤旁效应研究模型。
　　2．γ射线照射能引起细胞的旁效应，其效应与辐照细胞相同，并慢慢的修复。
　　3．低剂量的α粒子照射能诱导旁效应DSB损伤与修复的变化，并且其变化趋势与直接照射的细胞相似，都能产生二次DSB损伤。

目录

封面

声明

目录

主要英文缩略语索引

中文摘要

英文摘要

前言

第一部分辐射旁效应DNA损伤模型的构建

1. 材 料

1.1 实验细胞

1.2 质粒与菌株

1.3 主要试剂

1.4 主要仪器

2. 方法

2.1 细胞培养

2.2质粒构建

2.3 稳转细胞系HFS-RFP的构建

2.4辐射旁效应模型的构建

3 结果

3.1稳转细胞系HFS-RFP的鉴定

3.2 细胞共培养辐射旁效应细胞模型的构建

第二部分γ射线诱导的细胞辐射旁效应

1材料

1.1实验细胞

1.2实验试剂

1.3主要仪器

2.方法

2.1细胞培养

2.2细胞照射

2.3免疫荧光反应

2.4 激光共聚焦显微观察和结果分析

2.5统计方法

3.结果

3.1免疫荧光图片

3.2细胞在不同时间点γH2AX的foci量。

第三部分α粒子照射诱导的细胞旁效应

1.材料

1.1实验细胞

1.2实验试剂

1.3实验器材

1.2.方法

2.1细胞培养

2.2细胞照射

2.3细胞免疫荧光染色

2.4激光共聚焦显微观察和结果分析

2.5统计方法

3.结果

3.1α粒子诱发DNA双链断裂（DSB）旁效应

讨论

结论

参考文献

综述

硕士期间发表的论文和参与的科研项目

致谢