钙信号转导在TOCP诱导SH-SY5Y细胞自噬中的作用

摘要

目的
　　研究三邻甲苯基磷酸酯（Tri-ortho-cresyl phosphate，TOCP）的神经毒性机制，观察TOCP对calpain和蛋白酶体活性的影响，研究细胞内钙紊乱与钙信号转导对TOCP诱导SH-SY5Y细胞产生自噬的作用机制，以及探讨磷酸化和泛素化蛋白的降解机制。
　　方法
　　1.以RA诱导SH-SY5Y细胞分化，TOCP（0、0.25、0.5、1.0mM）染毒未分化与已分化的SH-SY5Y细胞12h、24h和48h，以DMSO为对照组，采用20μM verapamil、100μM2-APB、20μM verapamil合并100μM2-APB分别预处理未分化与已分化的SH-SY5Y细胞15min再染毒1.0 mM TOCP48h，荧光分光光度计测calpain活性变化，并用Western Blot测钙通道抑制后LC3-II/I蛋白表达。
　　2．500 nM Calpastatin peptide ac184-210和自噬抑制剂3-MA（1.0 mM）分别预处理未分化与已分化的SH-SY5Y细胞6h和4h后染毒1.0 mM TOCP48h， DMSO为对照组，收集细胞，Western Blot测LC3II/I和Beclin1蛋白的表达。
　　3．不同浓度TOCP染毒未分化与已分化的SH-SY5Y细胞48 h，Western Blot测MAP2、p62和Ub蛋白的表达。
　　4.培养未分化的SH-SY5Y细胞，用TOCP（0、0.25、0.5、1.0 mM）进行染毒，染毒时间分别为6h、12h、24h、48h和72h，荧光分光光度计测定20S和26S蛋白酶体活性变化。
　　结果
　　1. calpain活性变化：随着TOCP染毒浓度和染毒时间增加，已分化与未分化的SH-SY5Y细胞内calpain活性升高（P<0.05）；用verapamil、2-APB及verapamil合并2-APB预处理细胞后染毒TOCP发现，TOCP诱导的calpain活性均一定程度地受到抑制（P<0.05）。
　　2.自噬蛋白表达：未分化与分化的SH-SY5Y细胞结果显示，与对照组比较，1.0 mM TOCP染毒组LC3-Ⅱ的表达均显著增高（P<0.05）；与1.0mM TOCP染毒组比较，verapamil预处理组抑制TOCP诱导的LC3-Ⅱ表达（P<0.05），verapamil合并2-APB组部分抑制LC3-Ⅱ的表达（P<0.05），2-APB增高LC3-Ⅱ表达（未分化组：P>0.05，分化组：P<0.05）；在未分化的SH-SY5Y细胞，calpastatin能抑制 TOCP诱导的LC3-Ⅱ表达，与对照组无差异（P>0.05），部分抑制 Beclin1表达（P<0.05）；在分化的SHSY5Y细胞，calpastatin部分抑制LC3-Ⅱ和Beclin1的表达（P<0.05）；未分化与分化的细胞中，3-MA+TOCP组 LC3-Ⅱ和Beclin1均发生明显的抑制作用（P<0.05）。
　　3. p62、MAP-2和泛素化蛋白表达：未分化与分化的SH-SY5Y细胞中，随着TOCP浓度增高，MAP-2和p62表达降低（P<0.05），泛素化蛋白表达均增高，尤其是高分子量的蛋白泛素化表达更明显。
　　4.蛋白酶体活性变化：不同浓度的TOCP染毒未分化的SH-SY5Y细胞不同时间，与对照组比较，20S proteasome CT-L、T-L、PGPH和26S proteasome CT-L、PGPH活性在不同染毒浓度和时间出现不同程度的升高，26S proteasome T-L活性随着染毒浓度的增加和染毒时间的延长呈降低趋势，差异均有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。
　　结论
　　1. TOCP能诱导已分化与未分化的SH-SY5Y细胞calpain活性，T/L-型钙离子通道和内质网上的IP3R参与细胞内钙信号转导。
　　2. T/L-型钙离子通道造成细胞内calpain活性改变是TOCP诱导自噬的重要原因。
　　3. TOCP能造成已分化与未分化的SH-SY5Y细胞泛素化积聚，抑制p62的表达，泛素化蛋白可能通过p62介导进入自噬溶酶体途径降解。

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前言

材料与方法

1. 材料

1.1 细胞系及培养

1.2 主要试剂和材料

1.3 主要仪器

2. 实验方法

2.1 calpain活性测定

2.2 Western Blot 检测蛋白

2.3 20S 和26S proteasome活性测定

3. 统计学方法

结果

1. Calpain活性测定结果

1.1 TOCP活化SH-SY5Y细胞calpain活性

1.2 钙通道阻滞剂抑制TOCP诱导的SH-SY5Y细胞calpain活性

2. 钙信号抑制后染毒TOCP对SH-SY5Y细胞自噬蛋白的影响

2.1 钙通道抑制剂verapamil和2-APB预处理后对自噬蛋白表达影响

2.2 calpastatin抑制calpain活性对TOCP引起自噬的影响

3. TOCP对p62、MAP-2及泛素化蛋白表达的影响

4. TOCP染毒未分化的SH-SY5Y细胞对蛋白酶体活性的影响

讨论

结论

参考文献

综述

公开发表论文和参与的科研项目

附录

致谢