CD4+T细胞亚群在血吸虫虫卵肉芽肿形成中的作用

摘要

目的：
　　通过构建日本血吸虫病Balb/c小鼠模型，研究CD4+T细胞亚群及其Th1/Th2、Th17/Treg失衡在日本血吸虫病肝虫卵肉芽肿形成中的作用，完善日本血吸虫致病机制，为血吸虫病治疗提供新的靶标。
　　方法：
　　用日本血吸虫尾蚴感染Balb/c小鼠，构建4w、6w、8w、10w、12w、16w、20w、24w不同时间点日本血吸虫病小鼠模型，采用FCM检测各组小鼠肝脏和脾脏中CD4+T细胞亚群中Th1、Th2、Th17及Treg细胞百分比与比值变化；ELISA检测小鼠血清中相关细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β及IL-1β水平；Trizol法提取肝组织mRNA，real-time PCR检测肝脏组织中IL-2、IFN-γ、IL-12、IL-4、IL-10、IL-6、IL-23、IL-17、ROR-γt、Foxp3、TGF-β及IL-1β等分子mRNA表达水平；取小鼠肝组织切片，HE和Masson染色法观察肝脏病理变化。
　　结果：
　　小鼠肝组织切片HE染色及Masson染色观察到感染小鼠肝组织均发生不同程度的炎症反应；8w时出现了严重的虫卵肉芽肿和轻度胶原蛋白纤维沉积，第12w胶原纤维蛋白量达高峰，肝脏炎症反应和病变以8w～12w最为严重；16w后炎症反应开始减轻，20w～24w炎症反应进一步减轻，形成大量纤维瘢痕病灶，虫卵死亡液化形成空洞。
　　FCM结果显示：Th1和Th2细胞的百分比在感染组小鼠肝脏和脾脏显著性高于正常对照组，P<0.05，肝脏中Th1细胞比例在血吸虫感染第4w和16w为高峰值，分别是4.29±0.74％和4.90±0.14%，显著性高于其它时间点，Th2细胞比例在血吸虫感染第8w达高峰，为6.47±0.18%，显著性高于其它时间点；在正常对照组小鼠肝脏中Th1/Th2比值为3.17%，血吸虫感染第4w，Th1细胞百分比显著性升高，Th1/Th2比值为5.67%；感染第6w时，Th1细胞百分比显著性下降，而Th2细胞百分比显著性升高，此时Th1/Th2比值倒置为0.84%；在感染第8w时，Th1/Th2比值倒置为0.46%；感染10w时，Th1/Th2比值为0.47%，感染12w时，Th1/Th2比值为0.53%，而感染第16w时，Th1细胞比例显著性升高， Th2细胞比例显著性下降，Th1/Th2比值为1.55%，16w至24w，Th1/Th2比值均显著性低于正常对照组，但与16w比较无显著性差异。脾脏中Th1细胞比例在血吸虫感染第4w和16w为高峰值，分别是6.86±0.99%和6.0±0.6%，显著性高于其它时间点，Th2细胞比例在血吸虫感染第8w达高峰，为6.94±0.75%，显著性高于其它时间点；在正常对照组小鼠脾脏中Th1/Th2比值为3.17%，血吸虫感染第4w时，Th1细胞百分比显著性升高，Th1/Th2比值为5.86%；感染第6w时，Th1细胞百分比显著性下降，而Th2细胞百分比显著性升高，此时Th1/Th2比值倒置为0.8%；在感染第8w时，Th1/Th2比值倒置为0.54%；在感染10w时， Th1/Th2比值为0.58%，感染12w时，Th1/Th2比值为0.86%，而感染第16w时， Th1细胞比例显著性升高，Th2细胞比例显著性下降，Th1/Th2比值达2.34%，16w至24w，Th1/Th2比值均显著性低于正常对照组，但与16w比较无显著性差异。
　　Th17和Treg细胞百分比在感染组小鼠肝脏和脾脏均显著性高于正常对照组，P<0.05，肝脏中正常小鼠的IL-17A+Th17、IL-17F+Th17和Treg细胞比例分别为1.367±0.071、1.267±0.55和3.64±0.255；IL-17A+Th17和IL-17F+Th17细胞比例在血吸虫感染第8w和16w为高峰值，分别是29.58±1.195%、27.16±1.94%和30.057±1.54%、38.88±2.7%，显著性高于其它时间点；Treg细胞比例在血吸虫感染第8w达峰值，为31.8±0.4%，显著性高于其它时间点；在正常对照组小鼠肝脏中Th17/Treg比值为0.72%，各感染组小鼠Th17/Treg比值均显著性高于正常对照组，Th17细胞升高程度均显著性高于 Treg细胞，感染第16w时， Th17/Treg比值达峰值为4.35%。脾脏中正常小鼠的IL-17A+Th17、IL-17F+Th17和Treg细胞比例分别为1.79±0.07、1.34±0.112和3.613±0.14； IL-17A+Th17和IL-17F+Th17细胞比例在血吸虫感染第8w和16w为高峰值，分别是21.07±1.12%、17.22±1.12%和28.2±1.94%、27.9±1.62%，显著性高于其它时间点； Treg细胞比例在血吸虫感染第8w达峰值，为23.04±1.21%，显著性高于其它时间点；在正常对照组小鼠脾脏中Th17/Treg比值为0.86%；各感染组小鼠Th17/Treg比值均显著性高于正常对照组，Th17细胞升高程度均显著性高于Treg细胞，感染第16w时，Th17/Treg比值达峰值为5.99%。
　　real-time PCR结果显示：肝脏组织中IL-2、IFN-γ、IL-12、IL-4、IL-10、IL-6、IL-23、IL-17、ROR-γt、Foxp3、TGF-β及IL-1β mRNA的表达量均显著性高于正常对照组，P<0.05，其中IFN-γ和IL-12 mRNA表达量在感染4w达峰值，分别为52.52±3.13和123.9±2.48，IL-2 mRNA表达量在感染4w、16w达峰值，分别为123.9±2.48和133.6±2.95，与Th1细胞升高的时间点相一致；IL-4和IL-10 mRNA表达量在感染第8w达峰值，分别为140.6±5.36和12.77±1.94，与Th2细胞升高的时间点相一致；IL-6、IL-23、IL-17、ROR-γt mRNA表达量在感染第8w达峰值，分别为84.05±5.6、57.01±4.68、757.6±2.45和157.14±2.4，与Th17细胞升高的时间点相一致，Foxp3和TGF-βmRNA表达量在感染第8w达峰值，分别为87.88±8.25和1451.1±7.4，与Treg细胞升高的时间点相一致；IL-1βmRNA表达量在感染8w、16w达峰值，分别为38.05±4.82和23.7±4.82。
　　ELISA检测结果显示：小鼠血清IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-6、IL-23、IL-17、TGF-β、及IL-1β的表达量均显著性高于正常对照组，P<0.05，其中IL-2、IFN-γ含量在感染第4w、16w达峰值，分别为87.77±1.58、35.97±0.8和59.8±1.45、30.32±0.86；IL-4、IL-10含量在感染第8w达峰值，分别为58.8±0.41和189.4±3.46；IL-6、IL-23含量在感染第8w达峰值，分别为976.7±1.53和95.85±6.84；IL-17含量在感染第8w、16w达峰值，分别为174.47±0.2和161.4±0.43；TGF-β含量在感染第8w达峰值，其值为1212.8±0.5；IL-1β含量在感染第10w、16w达峰值，分别为43.33±0.96和32.33±0.86；ELISA检测结果与real-time PCR结果相吻合。
　　结论:
　　小鼠感染日本血吸虫后，随着肝脏病理损伤程度的增加，Th2、Th17及Treg细胞百分比及相关细胞因子显著性升高，导致Th1/Th2及Th17/Treg细胞比例严重失衡，Th2与Th17增高程度与肝虫卵肉芽肿病变严重程度相一致，说明Th2和Th17细胞共同作用及其Th1/Th2、Th17/Treg细胞比值失衡在日本血吸虫病肝脏免疫病理损伤中发挥重要作用。

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