CTLA4Ig与CD40Ig逆转录病毒局部转染供肾对异种鼠肾移植排斥反应的影响

摘要

【目的】
　　通过阻断 CD28-B7和CD40-CD40L共刺激通路，经 PLNCX2-FLAG-CTLA4Ig和PLNCX2-HA-CD40Ig双基因包装成逆转录病毒后局部转染入豚鼠肾脏，观察CTLA4Ig和CD40Ig局部转染对豚鼠到SD大鼠异种肾移植免疫耐受的诱导作用，为防治异种肾移植免疫排斥反应寻找新的途径。
　　【方法】
　　选用雄性SD大鼠（12-14周龄）、雄性豚鼠（12-14周龄）各40只，随机分为4组（每组SD大鼠、豚鼠各十只）。手术方式为将CTLA4Ig和CD40Ig逆转录病毒基因局部转染豚鼠肾脏，左侧肾脏异位移植到SD大鼠颈部，右侧肾脏冰块保存。第1组为空载体逆转录病毒对照组（A组）；第2组为CD40Ig基因逆转录病毒转染组（B组）；第3组为CTLA4Ig基因逆转录病毒转染组（C组）；第4组为CTLA4Ig和CD40Ig双基因逆转录病毒转染组（D组）。采用Westen bloting检测豚鼠右侧肾脏逆转录病毒转染效率。观察各组受鼠术后移植肾存活时间、受鼠存活时间。采用HE染色观察术后各组大鼠移植肾排斥反应级别，免疫组化技术检测Bax蛋白的表达，RT-PCR检测bcl-2/Bax mRNA的表达，并用流式细胞仪检测移植肾细胞凋亡率。
　　【结果】
　　1、Western blotting
　　供肾局部转染CD40Ig或CTLA4Ig后，其组织中可见CD40Ig和（或）CTLA4Ig表达。A组无CD40Ig和CTLA4Ig表达，B组可见CD40Ig表达，C组可见CTLA4Ig表达，D组可见CD40Ig和CTLA4Ig都表达。
　　2.移植肾及受鼠存活时间
　　A组大鼠移植肾存活时间为（8.1±2.1） d， SD大鼠的存活时间为(9.5±2.3)d； B组、C组和D组移植肾的存活时间分别为(13.1±2.2)d、（12.4±2.6)d和（16.6±3.0)d,受鼠存活时间为(14.4±3.1)d、（14.5±3.3)d和（18.8±2.7)d，均明显长于A组（P<0.05)，其中D组移植肾及SD大鼠存活时间最长，与其他3组比较，差异均有统计学意义（P<0.05)。而B、C两组之间比较无明显统计学差异（P>0.05）。
　　3. HE染色
　　A组术后移植肾组织HE染色可见大量淋巴细胞浸润，Banff07移植肾病理分级为IIB-III级，提示移植肾排斥反应强烈。B组、C组也可见淋巴细胞浸润，但表达强度低于A组，Banff07移植肾病理分级为IIA-III级。而D组淋巴细胞浸润最少，Banff07移植肾病理分级为IA-IIB级,明显低于其他三组。
　　4.免疫组织化学检测
　　A组移植肾组织Bax表达都呈棕褐色，为强阳性表达，强阳性率100％，B组、C组移植肾组织强阳性率分别为60％和80％，D组有1例成强阳性反应，4例成弱阳性反应，强阳性率20％（P<0.05)。
　　5.RT-PCR结果
　　RT-PCR结果显示,B、C、D组移植肾组织Bax mRNA的表达明显低于A组，其中以D组移植肾组织Bax mRNA的表达最低，bcl-2 mRNA表达则相反，D组表达最高，A组表达最低（P<0.05）。而B、C两组之间比较无明显统计学差异（P>0.05）。
　　6.移植肾细胞凋亡情况
　　B、C两组细胞凋亡率为（24.34±2.78）%、（26.21±2.69）%，明显低于A组（54.69±6.25）%（P<0.05），而D组细胞凋亡率最低，为（15.03±1.21）%，与A、B、C组相比有显著差异（P<0.05）。而B、C两组之间比较无明显统计学差异（P>0.05）。
　　【结论】
　　1、CTLA4Ig和CD40Ig基因逆转录病毒局部转染肾脏均具有延长移植肾存活时间的作用，但两者本身并没有明显差异。
　　2、同时转染CTLA4Ig和CD40Ig双基因逆转录病毒，能显著减轻异种移植肾的排斥反应，延长移植肾的存活时间。

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