敲低SAA基因表达对鼻咽癌CNE2细胞生长及凋亡的影响

摘要

目的：
　　利用shRNA技术沉默血清淀粉样蛋白 A（SAA）表达，检测该基因表达降低对人鼻咽癌CNE2细胞生长及凋亡的影响，为揭示SAA基因表达功能提供实验依据。
　　方法：
　　采用shRNA技术，构建3组针对SAA基因的shRNA真核表达干扰载体，并进行测序及blast对比鉴定；将shRNA真核表达干扰载体瞬时转染人鼻咽癌CNE2细胞，通过PT-PCR及Western-blotting技术，筛选出有效的小干扰RNA(siRNA)序列；利用shRNA技术和高表达载体分别沉默及过表达SAA基因，分别瞬时转染CNE2细胞后，检测及验证该基因在 CNE2细胞中的表达水平；运用MTT及Hoechst33258荧光染色技术，观察及分析SAA基因的表达对CNE2细胞的生长及凋亡的影响。
　　结果：
　　成功构建针对SAA基因的shRNA真核表达干扰载体组，经测序鉴定、blast对比、 PT-PCR及Western-blotting检测，确定pGPU6/GFP/Neo-SAA-homo-482为针对SAA基因设计的最有效的干扰RNA。将pGPU6/GFP/Neo-SAA-homo-482和pCD3.1（+）-SAA瞬时转染人鼻咽癌CNE2细胞，PT-PCR及Western-blotting结果显示：pGPU6/GFP/Neo-SAA-homo-482真核干扰载体可有效沉默CNE2细胞中的SAA蛋白,pCDNA3.1（+）-SAA真核过表达载体可有效地过表达SAA蛋白，且其结果具有统计学意义（P＜0.05）；MTT及Hoechst33258荧光染色技术结果显示：SAA基因表达降低可促进CNE2细胞凋亡,增高可促进CNE2细胞生长。
　　结论：
　　1、 pGPU6/GFP/Neo-SAA-homo-482真核干扰载体可有效沉默 CNE2细胞中的SAA蛋白；
　　2、 SAA基因沉默可促进 CNE2细胞凋亡，SAA基因高表达可促进 CNE2细胞生长。

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声明

本课题资助项目

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中文摘要

英文摘要

前言

技术路线

材料与方法

一、实验材料

（一） 实验细胞株

（二）质粒

（三）主要试剂

（四）溶液配制

（五）主要仪器设备

二、实验方法

（一）重组质粒pGPU6/GFP/Neo- SAA真核表达干扰载体的构建

(二) 筛选最佳重组沉默质粒

(三) 检测鼻咽癌CNE2中SAA的表达

(四) MTT检测CNE2细胞生长

(五) Hoechst33258荧光染色检测CNE2细胞凋亡

（六）统计学处理

实验结果

（一） shRNA序列的测序及blast对比鉴定

（二） 筛选最佳重组沉默质粒

1、RT-PCR筛选最佳沉默载体

2、Western-blotting筛选最佳沉默载体

（三）检测鼻咽癌CNE2中SAA的表达

1、RT-PCR检测鼻咽癌CNE2中SAA mRNA的表达

2、Western-blotting检测鼻咽癌CNE2中SAA蛋白的表达

（四）MTT检测CNE2细胞生长

（五） Hoechst33258荧光染色检测CNE2细胞凋亡

讨论

结论

参考文献

主要缩略词及英文索引

综述

在读期间发表的论文

致谢