耐辐射球菌ddrO基因缺失突变株构建及ddrO基因功能初步研究

摘要

背景及目的:耐辐射球菌(Deinococcus radiodurans,DR)是迄今为止地球上发现的抗辐射能力最强的生物之一,同时DR对紫外线、过氧化氢、干燥及其它能够导致DNA损伤的因素也都有极强的耐受性。研究表明DR高效的DNA损伤修复能力是其具有超强抗性的关键。但DR的DNA修复机制至今仍不清楚。因此,研究DR潜在的高效的DNA损伤修复机制以及寻找和鉴定该菌体内可能与修复相关的特殊基因和酶,阐明它们的生物学功能,对进一步研究利用DR的极端抗性机制具有非常重要的意义。有研究认为ddrO(DR2574)基因可能是调节DNA辐射响应的主要候选基因,可能参与DR的DNA损伤修复途径,在DR的DNA损伤修复过程中发挥重要作用;但是目前ddrO基因的具体功能还不清楚。因此,本研究拟首先利用生物信息学方法分析预测ddrO基因的生物学功能;然后构建ddrO基因完全缺失突变株;同时在大肠杆菌(E.coli)中表达外源基因ddrO,分析改造后菌株抗逆性的变化,对DR ddrO基因的生物学功能进行初步的研究。
　　方法:1.运用生物信息学方法对ddrO基因及其对应蛋白产物DdrO的理化性质、高级结构及生物学功能等进行分析与预测;
　　2.利用体外三段连接和体内同源重组的方法对DR ddrO基因进行全基因缺失突变,紫外辐照和H2O2处理后对DR野生株、突变株的生存率等进行分析,初步研究ddrO基因在DR菌体内的生物学功能;
　　3.构建ddrO基因穿梭表达载体转化 E.coli并稳定表达,测定紫外辐射和H2O2氧化压力下改造菌株的存活率等,分析改造后 E.coli抗辐射和抗氧化能力的变化情况,研究DR DNA修复因子ddrO基因在其它生物中所起的生物学作用。
　　结果:1.生物信息学分析结果显示,仅在DR同属的耐辐射微生物Deinococcus geothermalis和Deinococcus deserti中发现与ddrO基因及DdrO蛋白高度相似的序列;并在嗜热菌属中发现了与DdrO蛋白部分相似的结构域。结构域分析发现DdrO含有HTH DNA结合结构域,该结构域高度保守,参与转录调控、DNA修复和复制、RNA代谢以及各种信号肽环境的蛋白之间的相互作用等,推测DdrO可能参与DR DNA损伤修复的调控途径。
　　2.PCR成功扩增了ddrO基因上游、下游和含有GroEL基因启动子的Kan抗性基因三个片段的连接产物(同源重组片段),转化DR后经Kan筛选得到ddrO缺失突变的阳性菌落,经鉴定成功构建了ddrO基因缺失突变株;ddrO基因缺失突变株的生长速度比野生型 DR有所降低;ddrO基因缺失突变株在紫外辐照和过氧化氢处理下的的存活率均低于野生型DR菌株的存活率,其差异均有统计学意义(P<0.05)。
　　3.构建了穿梭表达载体pRADZ3(+)ddrO,并在模式生物E.coli稳定表达了ddrO基因,发现在紫外辐照和强氧化剂 H2O2处理条件下改造后E.coli的存活率有明显提高,差异均有统计学意义(P<0.05)。
　　结论:1.生物信息学分析推测ddrO可能参与DR DNA损伤修复的调控途径。
　　2.成功构建了DR ddrO基因缺失突变株,ddrO基因缺失导致DR生长复制抑制、紫外辐射抗性和抗H2O2氧化能力降低,ddrO基因功能与DR DNA损伤修复能力相关。
　　3.DR ddrO基因在E.coli中的表达增强了E.coli的紫外辐射抗性和抗H2O2氧化能力,ddrO基因对细菌的的抗逆性有重要作用。

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引言

第一章 耐辐射球菌ddrO基因及DdrO蛋白的生物信息学分析

1 材料与方法

2 结果和分析

3 讨论

第二章 耐辐射球菌ddrO基因缺失突变株的构建和ddrO基因功能初步分析

1 材料和方法

2 结果和分析

3 讨论

第三章 耐辐射球菌ddrO基因在大肠杆菌中的表达及对其抗逆性的影响

1 材料和方法

2 结果与分析

3 讨论

第四章 展望与结论

展望：

结论

参考文献

文献综述

参考文献

成果目录

致谢