硫化氢可通过下调内质网应激改善糖尿病大鼠的心肌纤维化

摘要

研究背景及目的：
　　有研究表明，内质网（Endoplasmic reticulum，ER)应激可以通过多种途径诱导细胞凋亡，从而参与糖尿病（Diabetes mellitus，DM)心肌纤维化，因此，ER应激可能与糖尿病心肌病（Diabetic cardiomyopathy，DC)发生发展过程有关，最终影响心脏功能。然而，目前没有特殊的药物来预防和治疗DC。硫化氢（Hydrogen sulfide，H2S)是第3种气体信号分子，有多种生理和生物学作用，其中包括抗ER应激。之前有研究证明，H2S可以抑制DM大鼠心肌纤维化。但是，H2S抑制心肌纤维化的机制尚不明确。本研究旨在建立DM模型，探讨ER应激是否参与DM心肌纤维化，而H2S是否可通过下调ER应激，减少心肌细胞凋亡，从而改善DM大鼠心脏重构。
　　方法：
　　成年雄性 SD（Sprague-Dawley，SD)大鼠，随机分为5组：对照组（Control)；DM模型组（STZ)；低浓度保护组（C1)；高浓度保护组（C2)；H2S对照组（H2S)。然后对 STZ组、C1组和C2组大鼠腹腔注射（Intraperitoneal injection，ip)链脲佐菌素（Streptozotocin，STZ)(40 mg/kg)建立DM模型。STZ注射后的72 h，尾静脉采血测空腹血糖，高于16.7 mmol/L，认为DM模型成功建立。对C1组(30μmol/kg)、C2组(100μmol/kg)和H2S组(100μmol/kg)使用相应浓度硫氢化钠（Sodium hydrosulfide,NaHS)溶液腹腔注射作为H2S供体。实验8周后取大鼠心脏组织，用免疫组化染色法检测I、III型胶原纤维；马森（Masson)染色检测心肌胶原纤维；碱水解法检测羟脯氨酸表达水平；用苏木精伊红（Hematoxylin-eosin，HE)染色观察心肌病理变化；Western blotting法检测各组心肌组织ER应激相关蛋白糖调节蛋白78（Glucose regulated protein78，GRP78)、C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP)、Caspase-12，H2S生成酶胱硫醚-γ-裂解酶（Cystathionine-gamma-lyase，CSE)、巯基丙酮酸转硫酶（Mercaptopyruvate sulfurtransferase，MPST)以及凋亡相关蛋白 Cleaved Caspase-3的表达；透射电镜观察ER及心肌纤维形态。
　　结果：
　　1.成功建立DM大鼠模型。STZ注射72 h后检测血糖，结果显示血糖明显升高，且每只大鼠血糖均高于16.7 mmol/L。
　　2. H2S对DM大鼠BW、HW、HW/BW的影响。实验结束后DM大鼠BW和HW明显轻于对照组，HW/BW值明显高于对照组，提示DM大鼠心脏可能出现肥大，而H2S对DM大鼠BW，HW及HW/BW并无影响。
　　3.H2S可改善 DM大鼠心肌纤维化。免疫组化结果显示：DM大鼠心脏组织中I型和III型胶原纤维表达较对照组明显上升，且胶原纤维排列紊乱；而 H2S干预的DM大鼠心脏组织中 I型和III型胶原纤维表达明显下降。Masson染色结果显示：DM大鼠心脏组织中心肌胶原纤维沉积较对照组明显增加，而H2S明显减少 DM大鼠心肌胶原纤维沉积面积；碱水解法结果显示：脯氨酸在DM大鼠心脏组织中的表达明显高于对照组。而H2S减少了DM大鼠心脏组织中羟脯氨酸的表达。HE染色结果显示：DM大鼠心脏胶原排列紊乱，心肌纤维间隙增宽，而H2S可以改善DM大鼠心肌病理变化。透射电镜结果显示：DM大鼠心肌纤维出现水肿、排列紊乱、灶性溶解坏死；而 H2S可以减轻心肌纤维水肿，减少心肌纤维坏死。
　　4. H2S可上调DM大鼠H2S生成酶的表达。Western blotting法检测结果显示：DM大鼠心脏组织中H2S生成酶CSE及MPST的表达明显下降，而H2S可上调DM大鼠CSE及MPST的表达。
　　5. H2S可下调STZ诱导的DM大鼠心肌ER应激。Western blotting法检测结果显示：与对照组相比，DM大鼠心脏组织中 GRP78，CHOP和Caspase-12的表达明显升高，而H2S明显抑制了DM大鼠心脏组织中GRP78，CHOP和Caspase-12的表达。透射电镜结果显示：DM大鼠心肌ER出现不同程度的水肿；而H2S可以改善ER水肿。
　　6. H2S可减轻STZ诱导的DM大鼠心肌细胞凋亡。Western blotting法检测结果显示：DM大鼠心脏组织中Cleaved Caspase-3的表达较对照组明显升高，而H2S明显抑制了DM大鼠心脏组织中Cleaved Caspase-3的表达。
　　结论：
　　1.DM大鼠出现心肌纤维化，其机制可能与内源性 H2S生成减少，ER应激上调相关。
　　2.H2S可抑制DM大鼠心脏纤维化，机制可能与下调ER应激水平相关。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

主要缩略词中英文索引

第1章 前言

第2章 材料与方法

1. 试验材料

2. 试剂和药品配制

3. 实验方法

4. 统计分析

第3章 结果

1. 成功建立DM大鼠模型

2. H2S对DM大鼠体重、心脏重量、心脏/体重的影响

3. H2S可改善STZ诱导的DM大鼠心肌纤维化

4. H2S 可上调DM大鼠H2S生成酶的表达

5. H2S可改善STZ诱导的DM大鼠心肌ER应激

6. H2S可减轻STZ诱导的DM大鼠心肌凋亡

第4章 讨论

1.DM大鼠心肌纤维化及可能机制

2. H2S拮抗DM大鼠心肌纤维化及可能机制

第5章 结论

参考文献

综述:内质网应激与糖尿病心肌病的相关性研究

硕士期间发表论文

致谢