黄芪甲苷联合5-氮胞苷诱导hUCB-MSCs分化为心肌样细胞并抑制其凋亡

摘要

目的:5-氮胞苷（5-aza）是一种间充质干细胞（MSCs）分化的有效诱导剂，但存在较大的毒副作用。黄芪甲苷（AST）为黄芪制剂中的主要活性成分，也能诱导MSCs分化。本研究的目的旨在阐明AST联合5-aza对人脐血间充质干细胞（hUCB-MSCs）分化为心肌样细胞的影响，并探讨其对心肌细胞凋亡的保护作用。
　　方法:1.采用密度梯度离心法结合贴壁培养法体外分离和培养hUCB-MSCs，流式细胞术鉴定 hUCB-MSCs免疫表型抗原 CD34、CD44和CD29。2.取第3代hUCB-MSCs，分别予培养基（空白对照组）、5μmol/L5-aza（低剂量5-aza组）、10μmol/L5-aza（高剂量5-aza组）及200 mg/L AST+5μmol/L5-aza（AST+5-aza组）处理4周，显微镜下观察细胞形态学改变；采用免疫细胞化学染色法检测心肌肌钙蛋白T（cTnT）、Desmin表达；通过荧光实时定量PCR、western blot分别检测心房利钠肽（ANP）mRNA、蛋白表达；行酶联免疫吸附法（ELISA）测定细胞内环磷酸腺苷（cAMP）含量。3.在hUC-MSCs诱导分化4周后，予高糖（33 mmol/L）/葡萄糖氧化酶（2 mU/mL）处理12 h以诱导心肌样细胞凋亡，流式细胞术检测细胞凋亡率，western blot检测Bcl-2、Bax蛋白表达。
　　结果:1. hUCB-MSCs表面抗原CD34阴性，CD44、CD29阳性。2.诱导后细胞形态发生显著变化；空白对照组未见cTnT、Desmin表达，高剂量5-aza组、AST+5-aza组cTnT、Desmin表达水平较低剂量5-aza组升高（P<0.01），但AST+5-aza组与高剂量5-aza组之间无区别（P>0.05）；高剂量5-aza组、AST+5-aza组ANP表达水平、细胞内cAMP含量显著高于低剂量5-aza组（P<0.01），但AST+5-aza组上述指标与高剂量5-aza组相比，差异无显著性（P>0.05），而且各药物诱导组ANP表达水平、细胞内cAMP含量均高于空白对照组（P<0.01）。3.与空白对照组比较，低、高剂量5-aza组Bcl-2蛋白表达水平降低（P<0.05或0.01），细胞凋亡率、Bax蛋白表达水平升高（P<0.05或0.01），AST+5-aza组Bcl-2蛋白表达水平增加（P<0.05），细胞凋亡率、Bax蛋白表达水平减少（P<0.05）。
　　结论:1. hUCB-MSCs在体外能被AST联合5-aza诱导分化为心肌样细胞，其效果与10μmol/L5-aza相当。2. AST联合5-aza通过增加Bcl-2/Bax比值抑制心肌样细胞凋亡。

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主要缩略英文索引

引言

材料与方法

一、材料

二、实验方法

三.统计学处理

结果

1. hUCB-MSCs 培养

2. 细胞生长曲线

3. h UCB -MSCs 的鉴定

1. hUCB-MSCs 诱导后的形态学变化

4. AST联合5-aza对cTnT、Desmin表达的影响

5. AST联合5-aza对ANP mRNA、蛋白表达的影响

6. AST联合5-aza对细胞内cAMP 含量的影响

7. AST联合5-aza对细胞凋亡的影响

8. AST联合5-aza对Bcl-2、Bax蛋白表达的影响

讨论

结论

参考文献

综述:脐血间充质干细胞临床应用进展

在攻读硕士学位期间发表论文

致谢