基于汞介导的适体信标和金纳米复合物检测汞和MTs的新原理新方法

摘要

汞(Mercury)是一种剧毒的重金属,它对人类健康及生态环境的危害已经引起了人们的广泛关注。金属硫蛋白(metallothioneins,MTs)是一类低分子量、能结合大量重金属离子的热稳定性蛋白质,具有许多重要生物学功能。此外,金属硫蛋白作为环境中重金属污染的生物标志物也已被广泛应用。因此,建立一种简便、灵敏、快速、实用的检测汞和金属硫蛋白的新方法对环境监测、健康风险评价,以及生物学功能的研究都具有重要意义。
　　本文第二章基于汞介导的适体分子信标,建立了双通道测定汞和金属硫蛋白的新方法。实验设计了一条只在5′端标有荧光基团(6-FAM)、富含T碱基的寡核苷酸(TRO),将其置于p H=8.5的Tris–HCl缓冲溶液中,当存在汞离子时,通过T–Hg2+–T结构的形成,6-羧基荧光素(6-FAM)标记的富T寡核苷酸能够折叠形成适体分子信标,首次发现,末端形成的T–Hg2+–T结构能够通过荧光共振能量转移猝灭6-FAM的荧光;金属硫蛋白与汞离子有着很强的结合力,实验发现加入MTs之后,体系的荧光恢复,表明MTs能够与Hg2+结合,破坏T–Hg2+–T结构。基于T–Hg2+–T结构的形成和破坏,建立了双通道测定汞离子和金属硫蛋白的新方法。Hg2+的浓度为1.42×10-8~3.0×10-7 mol·L-1时,体系的ΔF与Hg2+浓度有良好的线性关系。回归方程为ΔF=–18.79+301.2c(×10-7 mol·L-1),r=0.9991,检出限为4.28×10-9 mol·L-1。MTs的浓度在5.63×10-9~2.75×10-7mol·L-1范围内,与体系荧光峰值强度变化呈良好线性关系,线性回归方程为ΔF=–42.27+365.3c(×10-7 mol·L-1),r=0.9987,检出限为1.69×10-9 mol·L-1。本文设计的适体分子信标只需对核酸探针进行单荧光基团标记,节约了实验成本;富T寡核苷酸链末端形成的T–Hg2+–T结构能够猝灭荧光基团的荧光这一发现,为新型分子信标的构建提供了新思路和实验依据。提出的方法已用于实际样品的检测,进一步证明本方法的可行性。本文第三章建立了基于金纳米粒子-吖啶橙表面能量转移检测金属硫蛋白的新方法。实验发现,加入金纳米粒子之后,荧光染料吖啶橙被金纳米粒子表面吸附,通过表面能量转移导致体系荧光强度减弱。加入MTs之后,MTs能与金纳米作用形成复合物,吖啶橙脱离金纳米表面,荧光恢复。据此建立了一种测定MTs的荧光传感分析法。在最优实验条件下,体系最大荧光峰位于524 nm。MTs浓度在9.3×10-9~1.5×10-7 mol·L-1范围内,与体系荧光强度变化值呈良好线性关系,线性回归方程为ΔF=3.798+337.3c(×10-7 mol·L-1),r=0.9965,检出限为2.79×10-9 mol·L-1。该方法灵敏度高,便于操作。可以应用于实际样品中MTs的测定。

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主要缩写符号与对照

第一章 前 沿

1.1 研究意义

1.2 汞和金属硫蛋白检测方法简介

1.3 核酸探针

1.4 羧基荧光素

1.5 本研究的主要内容

第二章 基于汞介导的适体信标双通道检测汞和金属硫蛋白

2.1 引言

2.2 实验部分

2.3 结果与讨论

2.4 标准曲线、检出限及精密度

2.5 干扰物的影响

2.6 样品分析

2.7 结论

第三章 基于金纳米粒子-吖啶橙表面能量转移检测金属硫蛋白

3.1 引 言

3.2 实验部分

3.3 结果与讨论

3.4 样品分析及回收率测定

3.5 结论

参考文献

文献综述:金属硫蛋白的研究进展

作者攻读学位期间的科研成果、获奖

致谢