耐盐根瘤工程菌的获得及接种后对紫花苜蓿生长的影响

摘要

近年来，应用基因工程手段改造自然界中现有根瘤菌的某些遗传性状，如结瘤竞争力、固氮酶活性、吸氢酶活性、耐氨、耐盐性等，已经成为生物技术在农业上应用的一个重要研究方向。而构建高效耐盐的根瘤菌工程菌株，提高根瘤菌耐盐水平，为生物肥料的研制奠定基础则具有重要的应用价值。 本研究以啤酒酵母为材料，利用PCR技术分离得到耐盐基因HAL1，其编码框全长885bp，编码294个氨基酸。将HAL1插入到原核表达载体pGEX-4T-1的EcoRI和XhoI位点中间，转化大肠杆菌，经三亲杂交导入苜蓿根瘤菌得到耐盐工程菌株。用此工程菌接种紫花苜蓿，研究了接种后对紫花苜蓿生长的影响。 主要取得以下研究结果： 1.工程菌中的重组质粒在自生培养条件下传代的稳定性：将纯化的工程菌在YMA培养基中连续转接5次后检测其丢失率，结果表明在无抗性选择的情况下，连续转接重组质粒基本没丢失，证明重组质粒pGEX-HAL1在苜蓿根瘤菌中能够稳定存在和遗传。 2.工程菌中融合蛋白：提取工程菌中的融合蛋白并进行纯化，结果表明当诱导时间为3h，IPTG浓度是1 mmol/L 时，融合蛋白产量最多。1ml培养物中产生的融合蛋白大约有3mg，纯化蛋白占可溶总蛋白的1.56％。 3.工程菌在不同盐浓度培养基中的生长情况：把苜蓿根瘤空白菌和携带 HAL1的工程菌分别接在含3％、5％、7％和9％NaCl的YMA培养基中，结果表明，在相同盐浓度的培养基中，工程菌的OD<,600>值都大于对照，说明工程菌的生长状态好于空白菌。 4.将苜蓿种在不同盐浓度的培养基中，然后用根瘤工程菌和根瘤空白菌接种，结果表明，工程菌接种后的植株在不同盐浓度培养基上的生长状况均比对照好。30d后空白菌接种的对照植株已经枯萎死亡，但工程菌接种的植株还明显带有绿色，由此可见工程菌接种后可提高苜蓿的耐盐水平。 5.工程菌的促生作用：把苜蓿种在灭菌沙土中，定期浇无氮营养液，待苜蓿长出第一片真叶时，分别接种工程菌和根瘤空白菌，40d后观察苜蓿的生长情况。结果表明用工程菌接种的苜蓿生长状况好于用根瘤空白菌接种的苜蓿。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

1引言

1.1我国盐碱地现状

1.2根瘤菌的研究与应用现状

1.2.1苜蓿根瘤菌资源调查

1.2.2根瘤菌耐盐研究

1.2.3根瘤菌的应用研究进展

1.3耐盐基因工程研究进展

1.3.1对耐盐机理的研究

1.3.2耐盐相关基因的克隆、鉴定与应用

1.4 HAL1的作用机理及研究进展

1.5研究背景、目的与意义

2材料与方法

2.1试验材料

2.1.1植物材料

2.1.2质粒和菌种

2.1.3试剂盒、酶类

2.1.4引物

2.1.5培养基

2.2试验方法

2.2.1酵母DNA提取

2.2.2 DNA浓度与纯度的测定

2.2.3 DNA片段的PCR制备

2.2.4 DNA片段的胶内回收

2.2.5 HAL1基因片段的TA克隆与测序

2.2.6原核表达载体的构建

2.2.7质粒的提取

2.2.8三亲杂交

2.2.9工程菌中的PGEX-GST-HAL1融合蛋白的诱导和分离

2.2.10工程菌的遗传稳定性测定

2.2.11受体苜蓿根瘤菌的结瘤实验

2.2.12耐盐性实验

2.2.13工程菌的促生作用

3结果

3.1 HAL1基因的克隆与测序

3.1.1 HAL1基因的克隆

3.1.2 TA克隆

3.1.3 HAL1的测序

3.2表达载体的构建

3.3工程菌株的筛选

3.4工程菌中的融合蛋白

3.4.1工程菌中融合蛋白的诱导表达及纯化

3.4.2工程菌中融合蛋白的含量的测定

3.5工程菌在自生传代培养条件下的稳定性测定

3.6受体苜蓿根瘤菌的结瘤实验

3.7耐盐性检测

3.7.1工程菌株耐盐性实验

3.7.2苜蓿接种工程菌后的耐盐实验

3.8工程菌的促生作用

4讨论

4.1关于转化基因的选择和对照植株结瘤的问题

4.2 GST融合蛋白提取中的参数优化

4.3工程菌中的重组质粒的稳定性问题

4.4关于耐盐工程菌今后的应用问题

5结论

参考文献

致谢

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