沙眼衣原体pORF5质粒蛋白通过上调DJ-1蛋白表达激活ERK信号通路抑制细胞凋亡

摘要

目的：沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis，Ct）能通过抑制宿主细胞凋亡以逃避宿主的免疫清除，但其抗凋亡机制并未完全阐明。本研究试图探讨 Ct质粒蛋白pORF5与ERK1/2信号转导通路和互作宿主蛋白DJ-1三者之间的关系以及对细胞凋亡的影响，为阐明Ct致病机制提供实验依据。
　　方法：用肿瘤坏死因子（TNF-α,20ng/ml）和放线菌酮（CHX,2μg/ml）诱导pORF5基因稳定转染的HeLa细胞（pORF5-HeLa）和空质粒稳定转染的对照HeLa细胞（GFP-HeLa）凋亡6h，利用Hoechst33342染色检测两组细胞凋亡情况，实时定量 PCR（qRT-PCR）和 Western blot分别检测凋亡相关蛋白 Bax、Caspase-3、Bcl-2的mRNA和蛋白表达水平；用ERK1/2特异性抑制剂PD98059（30μM/ml）预处理pORF5-HeLa细胞30min后，再用凋亡诱导剂（TNF-α/CHX）刺激 ERK抑制剂处理组 pORF5-HeLa细胞（PD98059/pORF5-HeLa）和未加抑制剂组pORF5-HeLa细胞6h，利用Hoechst33342，TUNEL染色和流式细胞仪检测两组细胞凋亡率，采用qRT-PCR和Western blot分别检测Bax、Caspase-3、Bcl-2的mRNA和蛋白表达水平；将sh-RNA-DJ-1病毒液感染pORF5-HeLa细胞，建立稳定干扰DJ-1表达的pORF5-HeLa细胞系及空白载体转染的对照细胞系；凋亡处理6h后，利用Hoechst33342，TUNEL染色和流式细胞仪检测稳定干扰DJ-1的 pORF5细胞以及对照组细胞的凋亡率，qRT-PCR，Western blot检测 Bax、Caspase-3和Bcl-2的mRNA和蛋白表达水平；用凋亡诱导剂（TNF-α/CHX）刺激经PD98059预处理的pORF5-HeLa细胞和未处理组细胞6h，Western blot检测两组细胞的 DJ-1蛋白表达；用凋亡诱导剂（TNF-α/CHX）刺激稳定干扰 DJ-1表达的pORF5-HeLa细胞和对照细胞6h，Western blot检测两组细胞的ERK1/2磷酸化水平。
　　结果:
　　1、Hoechst染色结果显示，对照组GFP-HeLa细胞出现较多固缩，碎裂，亮蓝浓染核，而pORF5-HeLa细胞核染色呈均匀，弥散荧光，pORF5-HeLa细胞的凋亡率较对照组下降32.4％（P<0.05）；pORF5-HeLa细胞中 Bax和 Caspase-3的mRNA水平较对照组分别下降5.6倍（P<0.01）和18.6倍（P<0.01）；pORF5-HeLa细胞中 Bax的蛋白水平较对照组下降78.2%（P<0.01），而 Bcl-2较对照上升167.8%（P<0.01）。
　　2、 Hoechst和TUNEL染色结果显示，ERK抑制剂处理组pORF5-HeLa细胞的凋亡率较未处理组升高了28.5%（P<0.05），ERK抑制剂处理组TUNEL阳性细胞百分率为（54.6±2.1）%，未处理组阳性细胞百分率为（12.5±3.4）%， ERK抑制剂处理组的 TUNEL阳性细胞百分率较未处理组升高了42.1%（P<0.05）；流式细胞仪检测结果显示，ERK抑制剂处理组的 pORF5-HeLa细胞的凋亡率较未处理组增加12.57%；ERK抑制剂处理组的pORF5-HeLa中Bax和 Caspase-3的 mRNA水平分别较未处理组升高2.5倍（P<0.01）和302.7倍（P<0.01）；WB结果显示，ERK抑制剂处理组的pORF5-HeLa中Bax蛋白水平较未处理组升高264.3%（P<0.01），Bcl-2蛋白水平较未处理组降低86.6%（P<0.01）。
　　3、Hoechst和TUNEL染色结果显示，shDJ-1-pORF5-HeLa细胞凋亡率较对照组增加30.8%（P<0.05），shDJ-1-pORF5-HeLa细胞中TUNEL阳性细胞百分率为（45.2±2.3）%，未干扰组仅为（8.3±2.0）%，DJ-1稳定干扰组的TUNEL阳性细胞百分率较对照组升高了36.9%（P<0.05）；流式细胞仪检测结果显示：shDJ-1-pORF5-HeLa细胞的凋亡率较对照组上升了17.05%；shDJ-1-pORF5-HeLa细胞中Bax和Caspase-3的mRNA水平分别是对照组的187.8倍（P<0.01）和3.6倍（P<0.01）；shDJ-1-pORF5-HeLa细胞中Bax的蛋白水平较对照组升高387.5%（P<0.01），Bcl-2蛋白水平较对照组下降91.0%（P<0.01）。
　　4、ERK抑制剂处理组的pORF5-HeLa细胞中的DJ-1蛋白表达水平与未处理组无差别（P>0.05）；shDJ-1-pORF5-HeLa细胞中的ERK1/2磷酸化水平较对照组下降了102.8%（P<0.05）。
　　结论：1、沙眼衣原体pORF5质粒蛋白具有抵抗细胞凋亡作用。
　　2、pORF5质粒蛋白通过上调宿主蛋白DJ-1的表达激活ERK1/2信号通路抑制细胞凋亡。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

第1章 绪 论

第2章 实验材料

2.1主要实验仪器

2.2 载体及细胞株

2.3 主要试剂盒

2.4主要实验试剂

2.5 其他

第3章 实验方法

3.1 pORF5质粒蛋白与细胞凋亡的关系

3.2 ERK活性对pORF5-HeLa稳转株凋亡的影响

3.3 DJ-1蛋白的表达对pORF5稳转株凋亡的影响

3.4 pORF5-HeLa细胞中ERK活性与DJ-1蛋白表达的关系

3.5 统计学分析

第4章 实验结果

4.1 pORF5质粒蛋白与细胞凋亡的关系

4.2 抑制ERK1/2的激活对pORF5-HeLa细胞凋亡的影响

4.3 干扰DJ-1蛋白的表达对pORF5-HeLa细胞凋亡的影响

4.4 pORF5-HeLa细胞中ERK的激活与DJ-1宿主蛋白表达升高的上下游关系

第5章 讨 论

第6章 结 论

参考文献

综述 ;γ 干扰素与自噬在抗沙眼衣原体感染中的作用

攻读学位期间的科研成果

致谢