二十二碳六烯酸诱导A549及HTB-182细胞凋亡的内质网应激机制研究

摘要

目的：
　　探索二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)对 A549、HTB-182细胞凋亡的影响及其内质网应激相关机制。
　　方法：
　　1.体外培养 A549、HTB-182细胞，分别经不同浓度（0μM、20μM、40μM、80μM、160μM、320μM）的DHA处理24h，CCK-8法检测细胞活力并计算IC50。
　　2.体外培养 A549、HTB-182细胞，各分为对照组和 DHA组， DHA组用80μM的DHA处理细胞。CCK-8法检测0h、3h、6h、12h、24h、48h的细胞活力并计算抑制率。
　　3.体外培养A549、HTB-182细胞，各分为对照组、DHA组，分别处理24h。流式细胞技术检测两种细胞的凋亡比例；Western-blot（WB）检测内质网应激上游因子BIP以及内质网应激相关性凋亡因子CHOP、JNK、p-JNK、Caspase-4的蛋白表达水平；同时， Real-time PCR（RT-PCR）检测BIP、CHOP mRNA水平；Caspase-4活性检测试剂盒检测Caspase-4的活性。
　　结果：
　　1.DHA浓度对细胞增殖的影响：在A549、HTB-182细胞，DHA组中20μM及40μM与对照组比较，OD值差异无统计学意义(P＞0.05)；80μM、160μM及320μM的DHA处理细胞后，OD值逐渐减低，与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05)。计算出DHA处理A549、HTB-182细胞后的IC50分别为121.022μM、138.417μM，用80μM浓度的DHA进行下一步实验。
　　2.DHA处理时间对细胞增殖的影响：在A549、HTB-182细胞，与对照组相比，经DHA处理12h、24h、48h，DHA对细胞的抑制率均升高(P＜0.05)，其中以24h时最高，故取24h进行下一步实验。
　　3.各组细胞凋亡率：在 A549细胞，结果显示 DHA组的凋亡率(12.85±0.47)%与对照组(3.30±0.21)%比较增加(P＜0.05)；在HTB-182细胞，结果显示DHA组的凋亡率(9.80±0.48)%较对照组(3.55±0.12)%增加(P＜0.05)。A549细胞对照组与HTB-182细胞对照组比较凋亡率差异无统计学意义(P＞0.05)；A549细胞 DHA组较 HTB-182细胞DHA组凋亡率更高(P＜0.05)。
　　4.内质网相关因子的检测：在 A549细胞，WB结果显示：BIP蛋白在对照组(0.36±0.06)有明显表达，DHA组(0.13±0.02)较对照组减少(P＜0.05)；与对照组(0.05±0.03)相比，DHA组的CHOP蛋白表达(0.53±0.14)增加(P＜0.05)；DHA组的Caspase-4蛋白表达(0.61±0.11)较对照组(0.07±0.02)s增加(P＜0.05)；DHA组的JNK蛋白表达(0.87±0.12)与对照组(0.90±0.19)比较，差异无统计学意义(P＞0.05)；DHA组的p-JNK蛋白表达(0.72±0.12)高于对照组(0.31±0.06)(P＜0.05)。RT-PCR结果显示：BIP mRNA在对照组(1.00±0.00)中有明显表达，DHA组(0.11±0.01)较对照组减少(P＜0.05)；DHA组 CHOP mRNA相对量(3.06±0.21)高于对照组(1.00±0.00)(P＜0.05)。
　　在HTB-182细胞，WB结果显示：BIP蛋白在对照组(0.35±0.07)中有明显表达，DHA组(0.17±0.05)较对照组减少(P＜0.05)；与对照组(0.14±0.03)相比，DHA组的CHOP蛋白表达(0.70±0.13)增加(P＜0.05)；DHA组的Caspase-4蛋白表达(0.53±0.12)较对照组(0.10±0.03)增加(P＜0.05)；DHA组的JNK蛋白表达(0.97±0.19)与对照组(0.98±0.18)比较，差异无统计学意义(P＞0.05)；DHA组的p-JNK蛋白表达(0.73±0.11)高于对照组(0.1±0.02)(P＜0.05)。 RT-PCR结果显示：BIP mRNA在对照组(1.00±0.00)中有明显表达，DHA组(0.37±0.02)较对照组减少(P＜0.05)；DHA组的CHOP mRNA相对量(2.59±0.11)高于对照组(1.00±0.00)(P＜0.05)。
　　5.Caspase-4活性检测：在 A549细胞， DHA组(572.25±11.73)较对照组(35.26±2.63)明显增加(P＜0.05)。在 HTB-182细胞，DHA组(635.70±10.40)高于对照组(35.33±1.31)(P＜0.05)。
　　结论：
　　DHA可诱导A549、HTB-182细胞凋亡而抑制其增殖，其机理可能是下调BIP，从而抑制未折叠蛋白反应。

目录

声明

主要缩略词简表

第1章 前言

第2章 材料与方法

一、主要试剂来源

二、主要仪器和设备

三、细胞系

四、技术路线

五、实验方法及步骤

六、统计分析

第3章 结果

1.DHA抑制A549、HTB-182细胞增殖

2.DHA促进A549、HTB-182细胞凋亡

3.DHA促进细胞凋亡与内质网应相关

第4章 讨论

第5章 结论

参考文献

附图

综述:DHA与肺部疾病的研究进展1

攻读硕士学位期间撰写论文

致谢