PDGF通过PI3K/AKT/mTOR/HIF-1α途径增强Warburg效应促进肺动脉血管平滑肌细胞增殖

摘要

背景和目的：肺动脉高压（PAH）是以肺循环阻力进行性升高、肺动脉重构为特征，最终导致右心功能衰竭和死亡的一种致命性疾病。肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）异常增殖和迁移是肺动脉重构的主要构成部分，抑制其异常增殖、迁移可有效逆转肺动脉重构，从而降低肺循环阻力。Warburg效应，又称有氧糖酵解，是指在有氧条件下糖酵解途径明显增强，表现为葡萄糖摄取增加，乳酸生成增加。最新研究显示 Warburg效应在 PAH发生发展中期重要作用，然而Warburg效应是否介导肺动脉平滑肌细胞异常增殖及其触发机制尚不清楚。血小板源性生长因子（PDGF）是受体酪氨酸激酶家族一员，已经研究发现 PDGF及其下游的信号通路参与恶性肿瘤细胞的Warburg效应调节，同时，也有研究表明PAH患者和动物组织模型中PDGF表达显著上调，并且PDGF促PASMCs增殖伴随着乳酸生产的增加，据此提出Warburg效应介导PDGF促进PASMCs增殖的假说。本课题拟分离培养 SD大鼠的PASMCs，分析 PDGF受体及其相关信号通路阻滞，Warburg效应阻滞对 PASMCs增殖的影响，进一步了解Warburg效应是否介导PDGF促进PASMCs增殖，PDGF通过何种信号通路调节PASMCs的Warburg效应，从而揭示Warburg效应在PAH发生发展中的作用和机制。
　　方法：（1）PASMCs的分离培养与鉴定：I型胶原酶消化法体外分离培养PASMCs。无菌条件下，分离提取SD大鼠的肺动脉主干及左右肺动脉干，剥离外膜、剔除内膜，经酶消化后，体外培PASMCs。在倒置显微镜下观察PASMCs生长状态以及形态特点；使用免疫细胞染色法对平滑肌α-actin肌动蛋白(α-SM actin)进行鉴定。（2）MTT、Western blot测定PASMCs增殖：用不同浓度（0、5、10、15 ng/mL） PDGF处理PASMCs不同时间（0、6、12、24 h），MTT法检测细胞的增殖率、Western blot检测增殖细胞核抗原（PCNA）蛋白的表达量。（3）Warburg效应的测定：?实验分组：设立空白对照组（即Control组）、PDGF组、PDGF+PDGF受体抑制剂Imatinib、PDGF+PDGF受体抑制剂Sorafenib、PDGF+Warburg效应抑制剂2-DG、PDGF+Warburg效应抑制剂DCA；?指标检测：试剂盒法检测胞外葡萄糖的摄取量，胞外乳酸的生成量，以及胞内ATP的生成量；Western blot检测Warburg效应关键酶Glut1，Glut4，MCT4，PDH， LDH，PCNA的表达量；MTT法检测细胞的增殖率。（4）信号通路的研究：?实验分组：设立空白对照组（即Control组）、PDGF组、PDGF+PI3K抑制剂、PDGF+mTOR抑制剂；?指标检测：试剂盒法检测胞外葡萄糖消耗量，胞外乳酸生成量，以及胞内ATP生成量；Western blot检测Warburg效应关键酶Glut1，Glut4，MCT4，PDH， LDH，PDK1，PCNA，HIF-1α的表达以及PI3K，AKT，mTOR总蛋白量、磷酸化水平；MTT法检测细胞增殖率。
　　结果：（1）I型胶原酶消化法分离培养的PASMCs，3天后可以发现PASMCs贴壁并且呈梭形的状态生长，7天后生长迅速，12天后达90%融合。通过形态学观察及免疫组织化学染色法鉴定表明：培养的细胞为 PASMCs。（2）PASMCs的增殖率、PCNA蛋白表达量随PDGF处理浓度增加而增加（P<0.05）；PASMCs的增殖率、PCNA蛋白表达量随PDGF处理时间增加而增加（P<0.05）。（3）与未加PDGF的Control组相比，15 ng/mL的PDGF能明显增加胞外葡萄的摄取量，乳酸的生成量，促进Glut1, Glut4, MCT4, LDH的表达（P<0.05），明显降低胞内ATP的生成量，抑制PDH的表达（P<0.05）；与 PDGF组相比，加入 PDGF受体抑制剂 Imatinib和Sorafenib后，能明显减少PDGF诱导的胞内葡萄的摄取量，乳酸的生成量，以及抑制 PDGF诱导的Glut1，Glut4，MCT4，LDH的表达（P<0.05），同时，明显增加ATP的生成量，以及促进PDH的表达（P<0.05）；与 PDGF组相比，PDGF受体抑制剂 Imatinib和Sorafenib，及Warburg效应抑制剂2-DG和DCA能明显抑制PDGF诱导的PASMCs增殖（P<0.05）。（4）与未加PDGF的Control组相比，15 ng/mL的PDGF能明显增加PI3K，AKT，mTOR磷酸化水平（P<0.05）；与PDGF组相比，PDGF受体抑制剂Imatinib和Sorafenib明显抑制PDGF诱导的PI3K，AKT，mTOR磷酸化（P<0.05）， Warburg效应抑制2-DG和DCA对PDGF诱导的PI3K，AKT，mTOR磷酸化无明显抑制作用；与PDGF组相比，PI3K和mTOR抑制剂明显减少PDGF诱导的葡萄消耗量，乳酸生成量，以及抑制Glut1, Glut4, MCT4，LDH，HIF-1α，PDK1的表达量（P<0.05），同时能明显增加PDGF诱导的ATP的生成量，以及增加PDH的表达（P<0.05）；与PDGF组相比，PI3K和mTOR抑制剂能明显抑制PDGF诱导的PASMCs增殖（P<0.05）。
　　结论：1. PDGF促PASMCs增殖伴随Warburg效应的增强。
　　2. PDGF通过 PI3K/AKT/mTOR/HIF-1α/PDK1途径增强Warburg效应促进肺动脉血管平滑肌细胞增殖。

目录

声明

专业名词缩写中英文对照表

第1章 绪论

第2章 实验材料

2.1 主要试剂

2.2 主要仪器

第3章 实验方法

3.1肺动脉平滑肌细胞的分离培养

3.2肺动脉平滑肌细胞的鉴定

3.3 MTT比色法检测细胞增殖率

3.4 Western blot法检测蛋白表达

3.5氧化酶-过氧化酶法检测胞外葡萄糖的摄取量

3.6荧光素酶发光法检测胞内ATP的生成量

3.7还原法检测胞外乳酸的生成量

3.8 统计学分析

第4章 实验结果

4. 1 肺动脉平滑肌细胞分离培养与鉴定

4. 2 PDGF呈浓度、时间依赖性促进PASMCs增殖

4. 3 PDGF促进PASMCs增殖伴随Warburg效应增强

4.4 PDGF增强PASMCs Warburg效应的相关信号通路的研究

第5章 讨论

第6章 结论

参考文献

文献综述:The Warburg effect:a new story in pulmonary arterial hypertension

科研成果

致谢