白藜芦醇经Sirt1-Derlin1机制保护RLE-6TN细胞免于内质网应激诱导性凋亡的研究

摘要

目的：
　　探索 Sirt1激动剂白藜芦醇是否通过上调 Derlin1的表达对RLE-6TN细胞产生凋亡抑制作用。
　　方法：
　　体外培养RLE-6TN细胞株，利用10%CSE进行处理，同时用白藜芦醇进行干预。利用不同浓度的白藜芦醇处理 CSE诱导的RLE-6TN细胞，CCK8法验检测不同浓度的白藜芦醇对CSE诱导的RLE-6TN细胞活力的影响，摸索最佳保护RLE-6TN细胞活力的白藜芦醇浓度。以10%CSE诱导RLE-6TN细胞的各时间点为CSE组（0h，3h，6h，12h，24h，48h），同时以用白藜芦醇处理的各时间点为白藜芦醇干预组（0h，3h，6h，12h，24h，48h），利用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率，Western blot检测各组细胞中Sirt1、Derlin1、CHOP、caspase12、JNK和p-JNK蛋白的表达，Realtime-PCR检测各组细胞中Sirt1mRNA及Derlin1mRNA的表达。选取Sirt1表达高峰的时间点，利用不同浓度的白藜芦醇处理CSE诱导的RLE-6TN细胞， Western blot检测Sirt1及Derlin1蛋白的表达。
　　结果：
　　1.细胞活力检测：RLE-6TN细胞经10%CSE诱导后，随着加入白藜芦醇浓度的递增，细胞活力呈上升趋势，在浓度为40μmol/L时细胞活力达到平台。
　　2.细胞凋亡率的检测：在 CSE组和白藜芦醇干预组，细胞凋亡率随时间延长均呈现逐渐增高趋势，每组各时间点之间两两比较差异均具有统计学意义（P<0.05）；除0h外，白藜芦醇干预组与CSE组同时间点相比凋亡率均较低，且差异有统计学意义（P<0.05）。
　　3.内质网应激诱导性凋亡通路激活的检测：（1）CHOP蛋白表达：CSE组，CHOP的表达随时间延长呈逐渐增长趋势，除3h与6h之间外，各时间点两两相比差异具有统计学意义（P<0.05）；白藜芦醇干预组，CHOP的表达随时间延长也呈逐渐增长趋势，且3h、6h、12h、24h、48h与0h相比，12h、24h、48h与3h相比，12h、24h、48h与6h相比，48h与12h相比差异具有统计学意义（P<0.05）；但是，白藜芦醇干预组较CSE组同时间点相比（除0h外），CHOP的表达均较低，且差异有统计学意义（P<0.05）。（2）Caspase12蛋白表达：CSE组，Caspase12的表达在3h开始增高，12h后增长缓慢，且3h、6h、12h、24h、48h与0h相比，12h、24h、48h与3h相比，12h、24h、48h与6h相比，48h与12h相比差异有统计学意义（P<0.05）；白藜芦醇干预组，Caspase12表达也呈现增高趋势，除12h与24h之间外，各时间点两两相比差异具有统计学意义（P<0.05）；但是，白藜芦醇干预组较CSE组同时间点相比（除0h外），Caspase12表达量均较低，在3h、12h、24h差异具有显著性（P<0.05）。（3）总JNK和p-JNK蛋白表达：JNK的表达量在CSE组和白藜芦醇干预组随时间延长无明显规律变化，但是p-JNK在CSE组随时间延长呈增高趋势，除24h与48h之间外，各时间点两两相比差异具有显著性（P<0.05）；在白藜芦醇干预组也随时间延长呈增高趋势，除12h与24h之间外，各时间点两两相比差异也具有统计学意义（P<0.05）；但是白藜芦醇干预组较CSE组同时间点相比（除0h），p-JNK表达量均较低，且在12h、24h、48h差异有显著性（P<0.05）。
　　4.Sirt1的表达：Western blot结果显示：在CSE组，Sirt1的表达随时间延长呈下降趋势，除24h与48h之间外，各时间点两两相比差异具有统计学意义（P＜0.05）；在白藜芦醇干预组，Sirt1的表达呈增加趋势，约在12h达到高峰，而后稍降低，但仍高于0h，除12h与24h之间外，各时间点两两相比差异具统计学意义（P＜0.05）；除0h外，白藜芦醇干预组与CSE组同时间点相比，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。Realtime-PCR检测显示 Sirt1mRNA的结果与Western blot结果基本一致。
　　5.Derlin1的表达：Western blot结果显示，CSE组随时间延长表达逐渐增加，各时间点两两比较差异有统计学意义（P＜0.05）；白藜芦醇干预组随时间延长也呈增加趋势，约在24h后达到高峰，除24h与48h之间外，各时间点两两相比差异有统计学意义（P＜0.05）；但白藜芦醇干预组较 CSE组增加明显，除0h外，同时间点相比于CSE组差异均有统计学意义（P＜0.05）。Derlin1mRNA的表达趋势与Western blot结果相一致。
　　6.不同浓度的白藜芦醇处理经CSE诱导的RLE-6TN后，Western blot结果显示Sirt1与Derlin1蛋白的表达与白藜芦醇的浓度均呈正相关关系。
　　结论：
　　Sirt1激动剂白藜芦醇可对CSE诱导的RLE-6TN细胞凋亡产生保护作用，其机制可能是通过上调Derlin1表达发挥作用的。

目录

声明

主要缩略词

第一章 前 言

第二章技术路线

第三章 材料与方法

一、主要试剂来源

二、主要仪器和名称

三、实验方法

第四章实验结果

1.CCK8实验检测RLE-6TN细胞活力的OD值

2.白藜芦醇对CSE诱导的RLE-6TN细胞凋亡的影响

3.白藜芦醇对CSE诱导的RLE-6TN细胞中CHOP、Caspase12、总JNK、pJNK等蛋白的影响

4.白藜芦醇对CSE诱导的RLE-6TN细胞Sirt1蛋白及mRNA的影响

5.白藜芦醇对CSE诱导的RLE-6TN细胞Derlin1蛋白及mRNA的影响

6.不同浓度的白藜芦醇对CSE诱导的RLE-6TN细胞Sirt1及Derlin1蛋白表达的影响

第五章 讨 论

第六章 结 论

参考文献

附图

综述: Sirt1在呼吸系统疾病中的研究进展

硕士期间撰写论文

致谢