抗寒梨种质资源RAPD的分子标记及其核心种质初步构建

摘要

抗寒梨种质资源是寒地果树资源的宝贵财富，对其深入研究有利于今后更科学有效的保存与利用。本试验主要以RAPD(随机扩增多态性DNA)分子标记为主要研究方法。对抗寒梨种质资源遗传多样性进行研究，揭示不同种间的亲缘关系及其分类地位；寻找不同种质的特有RAPD标记，为今后的种质鉴定、育种亲本选择及其杂交后代性状预测、早期选择提供研究依据；并初步构建抗寒梨的核心种质，便于资源的高效管理及遗传多样性的准确利用。主要研究内容如下： 1.用SDS方法，提取了梨基因组DNA，并对提取液成分进行了改进，提高DNA的质量和产量。 2.优化了RAPD反应体系。所得最优反应体系为：反应体积25μl其中模板DNA 20 ng/μl，引物1.0μl浓度10pM，TaqDNA聚合酶1.0U，dNTP 0.2 mmol/L，PCR Buffer(含Mg<'2+>)2.5μl。扩增程序为：预变性94℃4min，变性94℃45s，退火温度(37℃)45s，72℃延伸120s，共35个循环后，在72℃继续延伸5min，然后在4℃保存。 3.利用RAPD技术对抗寒梨107份种质资源遗传变异进行了研究，从180个10 bp随机引物中筛选出13个多态性引物用于正式扩增，共扩增出105条DNA带，其中多态性DNA带99个，多态性百分比达到94.3％。平均每个引物扩增的DNA带数目为8条。 4.有6份资源扩增出了一个以上的特有RAPD标记，据此可以进行资源鉴定或以此亲本的杂交后代早期选择。 5.利用DNA扩增结果构建了初级核心种质84份，并对其进行再聚类分析，得到结论如下： ①验证了前人对秋子梨系统、白梨系统、西洋梨系统的经典分类。但一些野生种的亲缘关系与经典分类学存在差别，待进一步深入研究。 ②通过聚类分析树状图及苹果梨和其他品种的相似系数表明：苹果梨和白梨系统的品种聚在一起，虽然在表型性状是白梨和砂梨的杂和体，显示出苹果梨与白梨有较近的亲缘关系，在分类地位上应归属于白梨系统。 6.首次尝试对抗寒梨种质资源进行核心种质构建，获得28份核心种质，并对核心种质的多样性和实用性进行了检验。 以上研究为抗寒梨种质资源的保护、利用奠定了分子标记研究的理论基础，同时，为进一步构建抗寒梨遗传连锁图谱、分子标记辅助育种、重要基因的图位克隆等奠定了基础。将对抗寒梨的分子遗传研究产生重要影响。

目录

文摘

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声明

1前言

1.1梨种质资源起源与演化

1.1.1梨种质资源调查、收集和保存

1.1.2形态学鉴定与分类

1.1.3孢粉学鉴定

1.1.4核心种质资源的保存和管理

1.2 RAPD技术的原理和特点

1.2.1 RAPD技术在果树种质资源研究中的应用

1.2.2品种鉴定和分类

1.2.3系谱分析

1.2.4构建遗传连锁图谱

1.2.5遗传多样性检测

1.2.6基因标记

1.3核心种质的构建

1.3.1核心种质的意义

1.3.2核心种质的内容

1.3.3核心种质的构建方法

1.4目的及意义

2材料与方法

2.1材料

2.2主要试剂和器材

2.2.1主要试剂

2.2.2主要器材：

2.3试验方法

2.3.1 DNA大量提取(SDS法)

2.3.2 DNA少量提取(SDS法)

2.3.3 RAPD-PCR扩增反应

2.3.4 RAPD扩增产物检测

2.3.5结果记录与分析

2.4核心种质构建选择

2.5核心种质检验

3结果与分析

3.1梨DNA的提取结果

3.2梨的RAPD反应体系及扩增程序的建立

3.2.1模板DNA适宜浓度的确定

3.2.2引物适宜浓度的确定

3.2.3 dNTP浓度的确定

3.2.4 TaqDNA聚合酶适宜浓度的确定

3.2.5循环参数对PCR-RAPD的影响

3.2.6适宜退火温度的确定

3.3梨资源RAPD-PCR多态性引物的筛选

3.4 RAPD扩增结果

3.5不同抗寒梨种质特有RAPD标记

3.6抗寒梨遗传关系分析

3.6.1.梨种质资源间的遗传距离

3.6.2聚类结果分析

3.7核心种质的初步构建

3.7.1核心种质的初步构建

3.7.2核心种质的评价

3.8苹果梨、库尔勒香梨分类地位的研究

4讨论

4.1梨叶片基因组DNA的提取

4.2影响RAPD分子标记几个因素

4.3抗寒梨RAPD特异标记

4.4抗寒梨的遗传分析

4.4.1抗寒理梨的分类地位

4.4.2关于苹果梨、库尔勒香梨的分类地位

4.5抗寒梨核心种质的构建方法的探讨

5结论

参考文献

致谢