鼠衣原体TC0668蛋白生物学特性的初步研究

摘要

目的： 构建鼠衣原体（Chlamydia muridarum,Cm）TC0668蛋白的原核表达质粒pGEX4T-tc0668，诱导GST-TC0668重组蛋白在大肠杆菌表达并纯化，制备目的蛋白鼠源性多克隆抗体和兔源性多克隆抗体，测定TC0668在HeLa细胞中的定位、时相表达及诱导细胞因子的表达情况，为了解TC0668在鼠衣原体致病过程中的作用机制，进而研究其在沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis,Ct）中的同源蛋白CT389奠定了基础。 方法： 1．利用软件比对TC0668蛋白和Ct毒力因子CT389蛋白的相似性。利用Sopma软件分析它的二级结构。采用在线软件Swiss-model搜索与TC0668蛋白结构最为接近的蛋白质，然后利用该蛋白为模板模拟TC0668蛋白的三级结构。 2．根据tc0668基因序列设计特异性PCR引物，以Cm野生型基因组为模板进行PCR扩增tc0668基因。回收目的片段与双酶切的pGEX4T-1相连，构建表达重组质粒pGEX4T-tc0668，转化大肠埃希菌（E.coli BL21），使用IPTG诱导GST-TC0668重组蛋白的表达，用GST-琼脂糖树脂纯化GST-TC0668重组蛋白，然后去内毒素。 3．将GST-TC0668重组蛋白分别免疫BALB/c小鼠和新西兰兔并收集抗血清，测定抗血清与GST-TC0668重组蛋白的反应及效价，纯化获得的目的蛋白鼠源性多克隆抗体和兔源性多克隆抗体。 4．预备单层HeLa细胞，以实验室保存的Cm NiggⅡ菌株感染单层HeLa细胞0、4、8、12、16、20和24h，收集感染后各个时间点感染标本的总RNA，利用实时荧光定量PCR（Real-time quantitative PCR，RTq-PCR）检测tc0668的mRNA水平，WB和间接免疫荧光法（Indirect immunofluorescence assay，IFA）检测4、8、12、16、20和24h感染标本的TC0668蛋白表达情况。 5．预备单层HeLa细胞，用Cm NiggⅡ菌株感染单层HeLa细胞24h，以IncA、HSP60等蛋白为对照，利用IFA检测感染24h后感染细胞中TC0668的定位情况。并通过感染周期不同时间点的IFA进一步确证。 6．预备单层HeLa细胞，分别用等量的Cm tc0668单基因突变菌株(Cmtc0668mut)和对应的Cmtc0668单基因野生型菌株(Cm tc0668wt)感染单层细胞，24h后收集上清和细胞裂解液，用蛋白芯片检测细胞上清液和裂解液中的细胞因子水平。 结果： 1．生物信息学结果显示，tc0668和ct389基因及其编码产物的相似性高达84%和92%，TC0668蛋白α-螺旋、无规卷曲和β片层的含量分别为17.4%、60.78%和21.81%。 2．PCR扩增获得大小约1227bp的目的片段，与tc0668基因预期大小相符合。将其连接到表达载体pGEX4T-1，获得重组质粒pGEX4T-tc0668。重组质粒转化大肠埃希菌E.coli BL21，IPTG诱导表达分子质量约为72kDa的GST-TC0668重组蛋白，与预期值相符。经GST琼脂糖树脂柱层析纯化，得到GST-TC0668重组蛋白。 3．GST-TC0668重组蛋白分别免疫BALB/c小鼠和新西兰兔，收获的免疫血清经纯化分别获得鼠源性和兔源性的多克隆抗体，经检测多克隆抗体均能识别GST-TC0668重组蛋白，且效价≥1:64000。 4．IFA对Cm NiggⅡ菌株感染HeLa细胞24h后表达的内源性蛋白进行定位，TC0668抗体标记与IncA抗体标记相似，而与Pgp3和HSP60不同的信号。 5．RTq-PCR结果显示，Cm感染HeLa细胞4h后，tc0668基因开始转录，16h表达量明显升高，之后维持高转录水平，WB和IFA结果显示，TC0668蛋白于4h开始产生，于16h左右显著增多，且持续到感染周期结束。 6．Cmtc0668mut和Cm tc0668wt菌株感染HeLa细胞24h后收集上清和细胞裂解液，用蛋白芯片检测细胞因子表达情况。与Cm tc0668wt菌株相比，tc0668mut菌株的感染细胞上清中有73个细胞因子表达下调，其中有统计学差异的有36个（P＜0.05）；33个细胞因子表达上调，其中有统计学差异的有10个（P＜0.05）。收集的细胞裂解液中，相比于Cm tc0668wt菌株，tc0668mut菌株的感染细胞裂解液中表达上调和下调的细胞因子部分与上清一致，另一部分则刚好相反。 结论： 1．TC0668蛋白可能为衣原体的一种早期分泌的包涵体膜蛋白。 2．TC0668蛋白可能通过调控细胞因子的表达影响生殖道病变。

目录

声明

主要英文缩略语索引

第一章 前言

二、实验材料

2.1 主要实验仪器

2.2 载体、菌株及细胞株

2.3 主要实验试剂

2.3.1主要试剂盒

2.3.2 主要实验试剂

2.4 试剂的配制

2.5 其他

三、实验方法

3.1软件分析Cm TC0668与Ct CT389的相似性

3.1.1 Cm的TC0668与Ct的CT389蛋白的序列比对分析

3.1.2 TC0668蛋白二级结构和三级结构的预测

3.2 pGEX4T-1/tc0668原核表达重组质粒的构建及鉴定

3.2.1 设计引物并合成

3.2.2提取Cm DNA模板

3.2.3 PCR扩增

3.2.4 PCR扩增产物的纯化

3.2.5 pGEX4T-1质粒的提取和纯化

3.2.6 pGEX4T-1空质粒的双酶切鉴定

3.2.7 纯化酶切后的pGEX4T-1空质粒

3.2.8 pGEX4T-1空质粒和PCR产物的亚克隆

3.2.9 制备感受态细胞

3.2.10 转化重组质粒

3.2.11 鉴定重组载体

3.3 TC0668重组蛋白的表达、纯化与鉴定

3.3.1 重组蛋白的表达

3.3.2 重组蛋白的纯化

3.3.3重组蛋白的鉴定

3.4 动物免疫重组蛋白

3.4.1 免疫新西兰兔

3.4.2 免疫BALB/c小鼠

3.4.3 多克隆抗体效价测定

3.5 间接免疫荧光分析目的蛋白在Cm感染细胞的定位

3.5.1 铺板

3.5.2 感染Cm

3.5.3 IFA检测目的蛋白的细胞定位

3.6 RTq-PCR、WB检测TC0668的内源性表达时相

3.6.1 RNA提取

3.6.2 去除RNA中微量基因组DNA

3.6.3引物设计

3.6.4 RTq-PCR检测tc0668mRNA的表达

3.7蛋白芯片检测经Cm tc0668mut和Cm tc0668wt菌株感染HeLa细胞后产生细胞因子的情况

3.7.1 细胞因子检测

3.7.2 统计学分析

四、实验结果

4.1 tc0668基因序列分析

4.2 TC0668氨基酸序列分析和蛋白结构预测

4.3 pGEX4T-1/tc0668原核表达载体构建及鉴定

4.3.1 tc0668基因PCR扩增结果

4.3.2 重组细菌PCR扩增结果

4.3.3 重组菌序列Blast比对分析

4.4 TC0668重组蛋白的表达、纯化与鉴定

4.4.1 pGEX4T-tc0668重组质粒的诱导表达及其表达性质分析

4.4.2 重组蛋白纯化

4.4.3 重组蛋白鉴定

4.5 免疫动物血清抗体效价分析

4.5.1 抗体效价分析

4.6 TC0668蛋白在HeLa细胞中的定位分析

4.7 TC0668蛋白内源性表达时相分析

4.8 Cm tc0668单基因突变菌株TC0668蛋白的WB鉴定

4.9 Cm tc0668mut和Cm tc0668wt菌株感染HeLa细胞后产生细胞因子的情况

五 讨论

六 结论

附录

参考文献

综述:衣原体致病机制研究进展

攻读硕士学位期间的研究成果

资助本论文实验的课题项目

致谢