甘草细胞生物反应器连续培养的研究

摘要

甘草在世界药用历史悠久，在中国中医理论系统里更是占据着重要地位。 目前，甘草面临严重的资源问题，利用植物组织培养和细胞培养等现代生物技术对甘草等药用植物进行研究迫在眉睫。而用生物反应器进行药用植物细胞培养生产次生代谢产物也显示出大规模工业生产的巨大潜力。 本文在前人的基础上研究改进设计了一套用于药用植物细胞培养的生物反应器连续培养系统。在对这套连续培养系统进行了细胞截留效率、沉降效率以及氧传质系数等主要指标的测试后，对该生物反应器系统的性能有了较为全面的描述。实验进行了胀果甘草愈伤组织诱导和悬浮细胞系的建立及培养，并对甘草细胞进行了摇瓶培养，生物反应器分批式培养以及生物反应器连续灌注式培养三种不同方式的培养。 实验发现，胀果甘草诱导愈伤组织的最优外植体为下胚轴，适宜培养基：MS+BA1.0mg/L+2，4-D2.0mg/L，甘草细胞培养培养基初始培养基为：MS+BA2.0mg/L+NAA0.4mg/L+IAA0.4mg/L+蔗糖30g/L。并在此培养基里添加30g/L的柠檬酸，初步解决了甘草细胞培养中常出现的细胞褐化问题，添加500mg/L的水解酪蛋白，发现对细胞的生长有明显作用。 对比三种培养方式，并分别测定了各培养过程中的细胞生长动力学曲线，营养消耗动力学曲线等，结果摇瓶培养迟滞期6天，10～20天为对数生长期，25天以后进入稳定期。 在整个生长过程中最高生长量(鲜重)为106.3g/L，是接种量的13倍以上，在培养的后期，营养物质几乎全被消耗。 甘草细胞的生物反应器培养，生长停滞或者生长抑制现象不明显，从培养的4～6d开始，就进入了指数生长期。 生物反应器分批式培养在培养21d的时候达到最大生物量，鲜重和干重分别为191.3g/L和15.8 g/L。 生长速率和比生长速率分别在第15d和12d达到最大。但是从培养的18d开始，由于培养液里营养的消耗，细胞生物量和有毒物质的积累，细胞生长减缓，细胞生长速率和比生长速率也出现小于0。 而生物反应器连续培养与分批培养方式相比，不仅鲜重和干重分别达到了288.5g/L和18.4g/L。而且由于连续的营养供给和废液排出，细胞生长受到的反馈抑制作用的现象得到明显改善，细胞生长速率没用明显减缓。 细胞生长的最高生长速率和比生长速率出现在培养的第12d和9d，而且到培养的第21d以后生长速率和比生长速率基本趋于平稳，没有出现小于0的现象。而且，在三种培养方式的最高生长速率比较来看，连续灌注培养高于分批培养20个百分点，高于摇瓶培养33个百分点。说明初步实现了植物细胞的连续培养。 本文的特色和创新在于设计了一套用于植物细胞连续培养的生物反应器系统，并以本系统基础，对胀果甘草进行了三种培养方式的悬浮细胞培养。比较得出所设计的植物细胞生物反应器连续培养系统的优势，为甘草细胞的生物反应器放大培养和大规模商业化生产提供参考和依据。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章绪论

1.1甘草应用历史、有效成分和药理作用研究概况

1.2药用植物以及甘草的资源现状堪忧

1.3药用植物细胞培养概况

1.4甘草的生物技术研究概况

1.5用于药用植物培养的生物反应器

1.6用生物反应器连续培养植物细胞

第二章甘草愈伤组织诱导和甘草细胞悬浮培养

2.1材料和仪器

2.2实验方法

2.3结果与讨论

第三章生物反应器连续培养系统

3.1生物反应器连续培养系统设计

3.2实验方法

3.3结果与讨论

第四章生物反应器连续培养甘草细胞

4.1材料和方法

4.2结果与讨论

第五章结论与讨论

5.1结论与创新

5.2对下一步工作的讨论

参考文献

附 录

注释说明清单

致谢

作者简历