苏云金杆菌三个亚种和两个工程菌株杀虫晶体蛋白的比较蛋白质组研究

摘要

为了比较研究苏云金杆菌(Bt)亚种间及其Bt工程菌的杀虫晶体蛋白，了解杀虫晶体蛋白组成与杀虫活性之间的内在关系以及深入研究外源基因的导入对杀虫晶体蛋白表达谱及其毒力的影响，本研究首次采用蛋白质组学方法比较分析了三种野生Bt亚种菌以及两种Bt工程菌的杀虫晶体蛋白的差异。即采用双向电泳(2-DE)最大限度地分离Bt不同亚种及工程菌的杀虫晶体蛋白，PDQUEST软件对2-DE图谱进行背景消减，斑点检测等分析，质谱鉴定胶内酶解的蛋白质点，并结合生物信息学对部份蛋白质的功能进行了分析。 从所得到的2-DE图谱可知，Bt三个亚种及工程菌蛋白质斑点主要分布在等电点4-7，分子量10-130kDa的区域。运用PDQUEST软件对扫描后的2-DE图谱进行斑点检测，匹配和量化，在各Bt的2-DE图谱上检测到了一定数量的蛋白质点。在Bt库斯塔克亚种4.0718菌株中检测到159±21个蛋白质点，在Bt武汉亚种140菌株中则检测到184±6个蛋白质点，Bt以色列亚种H14菌株中366±11个，工程菌XL004中370±4个，工程菌XL002菌株中240±4个。在Bt4.0718与Bt武汉亚种140的2-DE图谱上约有17个匹配蛋白质点。匹配率为10％；而在Bt4.0718与BtXL004中的2-DE图谱上约有62个匹配蛋白质点，匹配率为38％。初步反映了它们在毒力以及杀虫谱的相似性和差异性。 Bt库斯塔克亚种4.0718菌株中鉴定的晶体蛋白有Cry1Ac、Cry2Aa；Bt武汉亚种140菌株中鉴定有CryIG原毒素、CryH2、Cry1Ab16和Cry2Ac。在BtXL004工程菌中则鉴定了Cry1Ac，Cry2Aa；BtXL002工程菌中鉴定了蛋白有Cry1Ac。 可见鉴定的蛋白中在种类数量上仅有少部份为具有杀虫毒力的杀虫晶体蛋白，说明一种菌中杀虫晶体蛋白种类比较少。在三个Bt亚种中没有发现相同的杀虫晶体蛋白。但Bt库斯塔克亚种4.0718菌株中的晶体蛋白Cry1Ac与Bt武汉亚种140中的晶体蛋白Cry1Ab16、以及Bt库斯塔克亚种4.0718菌株中的晶体蛋白Cry2Aa与Bt武汉亚种140中的晶体蛋白Cry2Ac具有很高的同源性，其同源性都高于85％。反映了它们杀虫谱的相似。结合CPHmodles，DsViewerProTrial和Swiss-PdbViewer软件分析Cry2Ac和Cry2Aa毒性核心片段发现Cry2Ac与Cry2Aa的毒性核心片段空间结构基本一致，但在DomainⅡloop2(322IGGLPVYHNSTLH332)处存在显著差异，说明两者与中肠受体蛋白结合的亲和力不同，也是导致两个亚种不同杀虫毒力的原因之一。Cry1Ac和Cry2Aa在Bt库斯塔克亚种4.0718菌株和在转入了cry1Ac和虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅰ融合基因的工程菌XL004菌株中表达，但是这两种蛋白的表达量在前者明显高于后者，生测结果表明前者毒力也明显高于后者，说明晶体蛋白的表达量是晶体蛋白毒力的关键。 这5株菌株中都鉴定有热休克蛋白60和翻译延伸因子Tu这两种蛋白，可能在晶体蛋白形成过程中参与帮助蛋白的折叠中具有重要意义。除此之外，各菌株中均鉴定有一些特殊蛋白，如Bt库斯塔克亚种4.0718中的谷氨酸消旋酶、定位于膜的胞外蛋白等；Bt武汉亚种140中的Cag毒力岛蛋白；Bt以色列亚种中的翻译延伸因子G，热休克蛋白60，启动因子ppiase，ABC转运子，ATP结合蛋白等；在XL004工程菌中因子Tu，芽孢形成Ⅳ期蛋白A，丙氨酸脱氢酶；BtXL002工程菌中ATP结合蛋白oppD和组氨酸激酶等蛋白。 丙氨酸脱氢酶仅在Bt工程菌中鉴定出，这可能是由于工程菌生长在加有抗生素的培养基中的缘故。因为丙氨酸脱氢酶调节生物细胞内的氮代谢，从而可能间接调节抗生素的转化与合成。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩写表(中英文对照)

引言

材料与方法

结果与分析

讨论

结语

参考文献

附录

致谢

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