CMO和BADH双价基因的无选择标记表达载体转化苜蓿的研究

摘要

土壤盐碱化是影响农业生产和生态环境的严重问题，苜蓿既是改良土壤、保持水土的重要植物，同时又是重要的饲料作物。苜蓿转基因研究进行的较早、广泛也较成功。采用传统的育种方法，选育耐盐品种进展极为缓慢。随着分子生物学的发展，本课题研究是利用农杆菌介导法，将抗旱耐盐基因转入苜蓿中，从而可以提高苜蓿的耐盐碱性。 本研究主要以苜蓿的无菌子叶作为外植体，诱导体细胞胚发生。通过对培养基成分等一些影响因素的优化，完成苜蓿愈伤组织诱导、愈伤组织的分化、出苗以及生根的整个再生过程。利用根癌农杆菌介导法对其进行抗旱耐盐基因遗传转化的研究，以期获得转基因植株并对其进行有关耐盐碱性生理指标的检测，取得的主要结果如下： 1、本实验分别优化了苜蓿子叶节各个时期的培养基成分：(MS+2，4-D2.0mg/L+KT0.25 mg/L，蔗糖3％，pH5.8)培养基可诱导苜蓿可诱导苜蓿愈伤组织；在(MS+NAA0.05mg/L+6BA0.5 mg/L，蔗糖3％，pH5.8)和MS、1/2MS(蔗糖1.5％，pH5.8)培养基上正常发育、萌发成苗以及生根。 2、本实验利用农杆菌介导法将BADH和CMO双价耐盐基因导入苜蓿中，探讨了不同的侵染时间、不同的菌液的浓度等条件对转化效果的影响。结果表明，浓度(OD值)在0.3-0.5左右，侵染25分钟时的愈伤组织的侵染效果最好，转化率较高，并采用40mmol/L的含盐培养基对其进行筛选，转化过程中得到了抗性植株。 3、对得到的抗性植株提取其叶片DNA进行PCR检测以及PCR-southern鉴定，结果表明，PCR检测为阳性的两个单株均有与阳性对照大小完全一致的杂交带出现，与PCR检测结果完全吻合，而非转基因植株没有杂交信号出现，说明PCR产物确实是BADH基因，而不是苜蓿基因组中的同源序列，从而证明外源基因BADH和CMO已成功的整合到基因组中。 4、本实验对转基因阳性植株进行了耐盐性生理指标检测，分别为甜菜碱含量的对比测定、细胞膜透性、游离脯氨酸含量、丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性以及过氧化物酶活性。结果表明：甜菜碱、膜透性脯氨酸含量和丙二醛含量随着盐胁迫的增强在增加，且都高于无盐胁迫下的值，而SOD，POD活性则正相反，随着盐胁迫的减弱其活性逐渐减小，并且随着胁迫天数的增加逐渐下降。对转化苗在浓度为1.0％的碱性盐水浇灌条件下，定期测其生理指标，并与非转化苗的指标作对比，发现其甜菜碱的含量有所增加，但是其细胞膜透性、丙二醛含量有着明显的降低，而超氧化物歧化酶活性以及过氧化物酶活性有明显的提高，但对于脯氨酸二者则没有显著的差别。 综上所述：外源基因BADH和CMO已有效地整合到转基因阳性植株基因组中，并成功的获得了表达，从而使转基因阳性植株的抗旱耐盐碱性得到了提高。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:主要英文缩略词表

声明

第一章前言

1.1 植物的耐盐性与植物耐盐基因工程

1.2苜蓿组织培养再生体系的研究

1.3 苜蓿基因工程的研究进展及应用

1.4 本项研究的目的和意义

第二章 苜蓿高频再生体系的优化

2.1材料和方法

2.2结果与分析

2.3 讨论

第三章苜蓿遗传转化的研究及转基因植株的检测

3.1 实验材料

3.2实验方法

3.3 结果与分析

3.4讨论

第四章转CMO和BADH双价基因苜蓿耐盐碱相关生理指标的检测

4.1 试验材料与方法

4.2测定项目与方法

4.3 结果与分析

4.4讨论

结论

参考文献

图版说明

致谢

作者简介