虎杖蒽醌提取物抗锦鲤疱疹病毒作用效果研究

摘要

锦鲤疱疹病毒（Koi herpesvirus，KHV）是一种高传染性，高致病性，高死亡率的锦鲤疱疹病毒病（Koi herpesvirus disease，KHVD）的病原体又称鲤疱疹病毒3型（Cyprinid herpesvirus 3，CyHV-3）。自20世纪90年代末首次对KHV报道以来，这种病毒已经在世界范围内流行，对锦鲤和鲤鱼养殖产业造成重大经济损失。KHV 作为水生动物疫病病毒越来越被重视。KHVD的诊断方法和相关防治措施的研究越来越深入，但至今仍未开发出有效治疗该病的药物和疫苗。 虎杖提取物中蒽醌化合物具有多种药理作用包括抗病毒，抗菌，抗炎，抗癌等多种特性。多项研究已证实蒽醌类化合物对HSV-1、HSV-2、HIV、SARS、乙型肝炎病毒、流感病毒等均表现出一定的抑制作用。本研究旨在检测虎杖蒽醌提取物对KHV感染的抗病毒活性，试图发现用于治疗锦鲤疱疹病毒病有效药物制剂。研究内容及结果如下： 1. 虎杖蒽醌提取物及阳性对照药物利巴韦林在CCB细胞中最大安全浓度的测定。采用MTT法和CPE镜检法检测48 h内虎杖蒽醌提取物和广谱性抗病毒药物利巴韦林对CCB细胞的毒性作用。设置8组不同浓度的虎杖蒽醌提取物1.96μg/ml、3.91μg/ml、7.28μg/ml、15.63μg/ml、31.25μg/ml、62.5μg/ml、125μg/ml、250μg/ml的实验组，9组不同浓度的利巴韦7.28μg/ml、15.63μg/ml、31.25μg/ml、62.5μg/ml、125μg/ml、250μg/ml、500μg/ml、1000μg/ml、2000μg/ml、4000μg/ml及无药物作用的对照组。试验结果表明：虎杖蒽醌提取物浓度在31.25 μg/ml时，细胞存活率达80%以上。虎杖蒽醌提取物和阳性对照药物利巴韦林在 CCB 细胞中的 CC50 分别为 72.67±2.12 μg/ml 和 2638.79±2.36μg/ml。31.25μg/ml的虎杖蒽醌提取物不会影响CCB细胞形态或细胞密度的明显变化，在细胞毒性试验中被认定为最大无毒浓度，同时低浓度范围内（≤31.25 μg/ml）细胞毒性基本为零，且存在一定的促进CCB细胞增殖的情况。 2. 虎杖蒽醌提取物抗KHV病毒活性效果的研究。确定虎杖蒽醌提取物（1.96-31.2 5 μg/ml）和利巴韦林（15.63-500 μg/ml）最大无毒范围后进行病毒复制抑制试验。结果显示虎杖蒽醌提取物浓度为31.25 μg/ml时达到最大抑制率为78.63±5.47%，IC50=13. 67±0.47 μg/ml，TI（Pc）=5.48±0.49;阳性对照药物利巴韦林IC50=492.15±2.13 μg/ml，TI （R）=5.36±0.03。在直接杀灭病毒试验中，虎杖蒽醌提取物也显示出一定的直接杀灭 KH V病毒粒子的能力，最高病毒抑制率为32.21%。预先给药孵育的CCB细胞未产生抗K HV病毒吸附的能力，CPE镜检发现药物预先孵育组，与阴性KHV病毒对照组无明显差异。同时RT-PCR结果显示在0.1TCID50 KHV病毒感染组中31.25 μg/ml虎杖蒽醌提取物显示出良好的抗 KHV 病毒的能力，完全抑制 KHV 生命周期相关基因的转录。在动物攻毒试验中，虎杖蒽醌提取物也显示出较高的抗KHV病毒活性，延长试验鲤鱼死亡数时间，提高攻毒鲤鱼存活率。

目录

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