骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞与Wnt/β-catenin通路中β-catenin的关系

摘要

目的
　　扩张型心肌病(dilatedcardiomyoPathy，DCM)为死亡率较高的一种疾病，目前尚未报道其有效的治疗措施。近些年研究的干细胞治疗技术为它带来了新的曙光。本研究试图通过5-aza诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞，并了解在该过程中Wnt/β-catenin信号通路是否参与分化过程的调控，旨在为临床充分利用来源丰富的BMSCs(bonemarrowmesenchymalcells，BMSCs)移植治疗终末期扩张型心肌病提供有效的实验依据。
　　方法:
　　从200g左右的SD雄性大鼠股骨提取BMSCs，利用贴壁培养方法，培养至P3代细胞后利用流式细胞仪（flowcytometry，FCM）来检测细胞的表面抗原:主要选取CD29、CD34、CD45、CD105等四种表面抗原进行检测，从而达到鉴定骨髓间充质干细胞的目的。台盼蓝染色计数细胞活性。选择活性较好，纯度较高的细胞制成细胞悬液，随机均匀分成a组、b组、c组、d组，分别用0μmol/L，5μmol/L，10μmol/L，20μmol/L的5-aza进行干预，2周后比较总体细胞水平的活性率及心肌细胞的百分比，从而确定诱导分化的最佳浓度。此后将P3代骨髓间充质干细胞随机分成2组，即实验组及对照组。实验组为A组需加入最佳诱导浓度的5-aza培养24h诱导分化，经处理后更换为不含5-aza的培养基继续培养4周，根据培养时间的不同分成四组，即为培养第1周末、第2周末、第3周末、第4周末的各组细胞，分别对应为A1、A2、A3、A4四组。对照组B组不添加5-aza，参照A组的分组方法分别分为B1、B2、B3、B4四组;对各组细胞进行如下操作:①记录不同时期细胞的生长状态及形态;②行免疫荧光检测心肌细胞中的特异性cTnT来鉴定心肌细胞，计数心肌细胞百分比;③采用蛋白印迹法(westernblot,WB)检测各组cTnT及β-catenin蛋白表达量，比较各组蛋白表达的变化。
　　结果:
　　应用FCM检测显示贴壁法培养获取的P3代BMSCs高表达CD29、CD105（分别为93.37％、89.08％）;而极少的表达CD34、CD45(分别为0.89％、1.06％)。经台盼兰试验测定其整体活细胞百分率＞95％;
　　通过对P3代BMSCs分别加入浓度为0μmol/L，5μmol/L，10μmol/L，20μmol/L的5-aza进行干预的a组、b组、c组、d组，2周后细胞的活性率及心肌细胞的百分率分别如下:①总细胞活性率:a组为94.2±7.4(％)，b组为93.6±7.1(％)，c组93.5±6.7(％)，d组80.1±9.2(％)，将各组数据行方差分析得出，a组、b组、c组各组细胞间总细胞活性率无明显差异，但与d组比较，P＜0.05，有统计学意义。②心肌细胞百分比:a组、b组两组未见心肌细胞，心肌细胞百分比为0，c组心肌细胞百分率为3.33±0.58(％)，4.33±0.58(％)，将c组、d组行配对t检验得出，P＞0.05，无统计学意义。综合分析得出:c组即经10μmol/L的5-aza处理可将BMSCs诱导分化为心肌细胞，总细胞活性率较高。
　　由BMSC分化而来的心肌细胞经标记特异性eTnT蛋白的免疫荧光染色后，在显微镜下表现为染红色荧光的细胞，各组心肌细胞百分比分别为:A1组及B组所有组别细胞显镜下未见心肌细胞形成，百分比为0(％);A2心肌细胞百分率为3.33±1.53(％);A3组心肌细胞百分比为19.67±1.53(％)，A4组为25.67±2.1(％)。将所得数据行方差分析得出A2、A3、A4各组间P＜0.05，有统计学差异。westernblot技术检测cTnT的表达结果，A2组（1.231±0.017）、A3组为（6.606±0.227）、A4为（8.511±0.392）明显高于B1（0.824±0.012）、B2(0.826±0.138)、B3(0.827±0.02)、B4(0.827±0.004)，A1（0.819±0.062），A组、B组行配对t检验后得出，A2与B2、A3与B3、A4与B4，P＜0.05，有统计学意义，A1与B1，P＞0.05，无明显差异。A1、A2、A3、A4各组行方差分析，P＜0.05，各组间存在差异;B组行方差分析则未见差异。免疫荧光与westernblot检测cTnT结果是相一致的。
　　各组细胞β-catenin蛋白的表达结果为:B组各组细胞β-catenin蛋白的表达检测不出。A组各组表达如下:A1(1.877±0.044)、A2(7.634±0.329)、A3（1.084±0.092）、A4(0.473±0.025)，经方差分析得出各组之间差异有统计学意义。
　　结论:
　　1.全骨髓贴壁法培养可获得足量、可靠的BMSCs，其表达的表面抗原符合BMSCs的特征。
　　2.5-aza可成功诱导BMSCs分化为心肌细胞，且10μmol/l的5-aza浓度为本实验的最佳浓度。
　　3.BMSCs分化形成的心肌细胞表达的cTnT蛋白随时间延长而逐渐增加，分化形成的心肌细胞数量也随之增多。
　　4.β-catenin与cTnT表达的存在时间差异，推测在Wnt/β-catenin信号通路中，β-catenin可能参与调控BMSCs分化为心肌细胞。

目录

论文说明

摘要

引言

实验线路图

第一章 5-aza诱导BMSCs向心肌细胞分化

第一节 材料与方法

第二节 实验结果

第三节 讨论

第四节 结论

第二章 β-catenin在BMSCs向心肌细胞分化过程中的表达

第一节 材料与方法

第二节 实验结果

第三节 讨论

第四节 结论

全文结论

附图

参考文献

综述 Wnt／β-catenin信号通路与在干细胞分化关系的相关研究进展

英汉缩略词对照表

在读期间发表的主要学术论文及参与课题

致谢

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