CFL相互作用蛋白的鉴定及其在斑马鱼心脏发育中的初步功能研究

摘要

心脏是人体的重要器官，心脏发育相关基因正常发挥其功能是心脏发育的关键。探究心脏发育相关基因的功能，能够为了解先天性心脏病的发病机制和干预性治疗提供基础。
　　斑马鱼CFL基因是从斑马鱼胚胎的cDNA文库中克隆出来的一个心脏发育候选基因，可能在斑马鱼心脏发育过程中起重要作用。为研究该基因的功能，本文对CFL基因进行了生物信息学分析、制备了CFL蛋白的多克隆抗体、研究了斑马鱼胚胎发育过程中CFL基因的表达情况、RA信号对CFL表达的影响以及CFL与DVL2的相互作用。
　　生物信息学分析表明:CFL基因编码278个氨基酸，含有一个ZF-CXXC结构域。通过RT-PCR获得了CFL cDNA，表达、纯化了CFL蛋白并且制各了针对CFL的特异性多克隆抗体。胚胎原位杂交表明，CFL mRNA在斑马鱼发育各个时期均有表达。Western-blot结果表明，CFL在斑马鱼胚胎发育的过程中在胚胎期至36hpf期间表达呈现上升趋势，并且在24hpf时表达最强，36hpf后表达有所下调。在成年斑马鱼的心脏、肌肉、卵、眼睛、脊索、鳍和鳃部位均有表达。
　　胚胎抗体染色结果显示，在斑马鱼胚胎发育24hpf时，CFL蛋白的表达范围较广，并且在脊索中表达量较高，在心脏中CFL主要在心室区域表达。
　　本研究室前期研究结果显示CFL基因受到RA信号的调控。为进一步研究CFL对斑马鱼心脏发育的调控机制，本文利用RA的抑制剂DEAB处理了斑马鱼之后，在24hpf时期进行了胚胎原位杂交实验，分析了DEAB对CFL表达的影响。结果显示DEAB促进CFL表达的上调。运用免疫共沉淀技术分析RA处理的胚胎中CFL蛋白的表达情况，结果显示CFL表达有所上调。因此，RA促进CFL蛋白的表达。CO-IP实验结果显示，CFL蛋白与WNT通路重要成员DVL2蛋白之间存在相互作用，提示CFL可能是RA信号与Wnt通路之间的联系分子。
　　综上所述，CFL可能通过与DVL2的相互作用而联系RA信号与Wnt通路，进而在斑马鱼心脏发育过程中起到重要的作用。

目录

摘要

1 研究背景和文献综述

1．1 斑马鱼心脏发育概述

1．1．1 斑马鱼模型的选择

1．1．2 斑马鱼心脏发育过程及研究现状

1．2 蛋白质二硫键异构酶(PDIs)家族

1．2．1 含ZF-CXXC结构域的蛋白质与表观遗传学调控

1．2．2 CXXC家族基因与Wnt信号通路及RA信号通路的关系

1．3 本文研究意义

2 材料和方法

2．1 材料

2．1．1 酶类、抗体和试剂盒

2．1．2 细胞系、菌株和质粒

2．1．3 其它试剂

2．1．4 缓冲液和培养基

2．1．5 主要实验仪器和耗材

2．1．6 生物信息学软件及数据库

2．2 方法

2．2．1 PCR

2．2．2 琼脂糖凝胶电泳检测

2．2．3 质粒的酶切鉴定

2．2．4 酶切产物与载体的连接

2．2．5 E．coliTOP10感受态细胞的制备

2．2．6 连接子的转化

2．2．7 阳性转化子的筛选和鉴定

2．2．8 融合蛋白的表达

2．2．9 考马斯亮蓝染色分析

2．2．10 CFL抗原的大量制备及纯化

2．2．11 CFL多抗血清的制备

2．2．12 抗体效价检测

2．2．13 mRNA的转录合成

2．2．14 蛋白的提取

2．2．15 免疫共沉淀

2．2．16 Western-blot

2．2．17 斑马鱼Morpholino的处理及显微注射

2．2．18 细胞(胚胎)免疫荧光标记

2．2．19 视黄酸／DEAB处理胚胎

2．2．20 胚胎原位杂交

3 实验结果及其分析

3．1 斑马鱼CFL基因生物信息学分析

3．1．1 CFL基因的进化树分析

3．1．2 CFL蛋白结构域分析

3．1．3 CFL基因的CpG岛分析

3．2 CFL多克隆抗体的制备及分析

3．2．1 CFL基因的克隆及pMD-18T-CFL重组质粒的构建

3．2．2 pET-28a-CFL融合表达质粒的构建

3．2．3 融合蛋白的诱导表达及纯化

3．2．4 CFL多克隆抗体的制备及效价检测

3．2．5 Western blot实验分析CFL的表达情况

3．2．6 Western blot实验分析CFL在斑马鱼各组织中的表达

3．2．7 CFL在斑马鱼体内的表达情况

3．2．8 CFL Morpholino的有效性检测

3．2．9 pXT7-CFL质粒的构建

3．3 视黄酸及其抑制剂对CFL表达的影响

3．4 CFL与DVL2相互作用研究

3．4．1 pCMV-MYC-CFL质粒的构建

3．4．2 pCMV-tag2B-DVL2质粒的构建

3．4．3 CFL与DVL2的CO-IP

3．4．4 CFL与DVL2的亚细胞共定位

4 讨论

4．1 CFL基因的克隆及抗体的制备

4．2 CFL基因与心脏发育的关系

4．3 CFL基因可能参与RA信号及Wnt信号之间的cross-talk

4．4 CFL基因的研究有助于明确zf-CXXC的功能

结语

参考文献

附录1：中英文缩写词简表

附录2：攻读学位期间的学术论文

致谢

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