中药材鱼腥草株间的遗传多样性及其质量稳定性控制研究

摘要

本文以鱼腥草为材料，从中药材植株间遗传多样性角度探讨了鱼腥草的质量稳定性问题，在原GAP控制模式的基础上，建立了中药材的“最小一次投料量”数学模型及理论体系，进一步控制了中药材质量稳定性，也更深层次地完善了中药材的质量稳定性控制理论。本文首先从DNA、蛋白质角度与化学成分角度两个层面揭示中药材的原植物体具有遗传多态性现象;然后根据具有DNA多态性的中药植株个体在一定条件下遵循Hardy-Weinberg群体平衡定律，通过将中药指纹图谱信息量、DNA分子标记(ISSR、RAPD)分析结果所携带的信息量与信息熵原理相关联，建立能映射Hardy-Weinberg平衡群体的“最小一次投料量”的数学模型;最后运用该数学模型展开对鱼腥草模型中药的实验研究，测算出以Hardy-Weinberg平衡群体值，最终建立以此值为最小投料单元的中药材质量稳定性控制理论。为中药材质量稳定性控制提供一种新思路、新方法与实验数据。实验结果如下:
　　1.鱼腥草植株间DNA多态性研究:对同一GAP产地46株鱼腥草进行ISSR和RAPD分子标记，应用NTSYS2PC软件进行聚类分析，结果表明，将筛选出的9条ISSR引物及8条RAPD引物扩增后分别得到134和101条带，其中呈多态性的条带数分别为115和72条，多态比率分别为85.8％、71.3％，平均遗传相似系数分别为0.6786、0.6947。两种分子标记结果均揭示了同一GAP产地鱼腥草植株间具有基因多态性。
　　2.鱼腥草植株间蛋白质多样性研究:采用Ramagli改进的Bradford法、SDS-PAGE凝胶电泳法和双波长薄层扫描法等三种方法对鱼腥草植株间的蛋白质进行多样性研究，结果发现，53株蛋白条带分子量大多集中在6.5KD-97.2KD范围内，其蛋白种类差异性不明显，主要表现为条带颜色深浅不一;蛋白电泳条带的扫描图的总量统计矩零阶矩(AUCT)、一阶矩(MCRTT)和二阶矩(VCRTT)的RSD分别为40.92％、6.01％和18.57％。由此可见，同一GAP下不同植株鲜鱼腥草个体间蛋白质种类变化不大，但相应的含量显示出丰富的多样性。
　　3.鱼腥草植株间挥发性油指纹图谱多样性:提取得到77株鱼腥草挥发油，并建立了77张挥发油成分的气相色谱指纹图谱，运用总量统计矩指纹图谱分析法进行研究，结果表明，77株鱼腥草挥发油指纹图谱的总量零阶矩AUCT的RSD为341.56％，总量一阶矩MCRTT的RSD为51.43％，总量二阶矩VCRTT的RSD为65.71％;由此可见，种植在同一GAP产地的鱼腥草挥发油气相色谱指纹图谱间存在较大的变异性。
　　4.基于鱼腥草RAPD扩增条带信息熵的平衡群体研究:采用RAPD分子标记对同一GAP产地鱼腥草进行多态性分析，将扩增的条带信息转化成信息熵，运用数学模型测算鱼腥草的“Hardy-Weinberg”平衡群体，即最小一次投料量。结果发现，将筛选出的8条RAPD引物对同一GAP产地46株鱼腥草的DNA样品进行扩增，得到101条总条带，其信息熵为H=0.4488～0.9033，RSD为10.43％，计算得到一个“Hardy-Weinberg”平衡群体的值为287株，折算成一次最小投料量约为3.736kg。
　　5.基于鱼腥草ISSR扩增条带信息熵的平衡群体研究:采用ISSR分子标记对同一GAP产地鱼腥草进行多态性分析，将扩增的条带信息转化成信息熵，运用数学模型测算鱼腥草的最小一次投料量。结果发现，将筛选出的9条ISSR引物对同一GAP产地46株鱼腥草的DNA样品进行扩增，得到134条总条带，其信息熵为H1=0.3656～0.9786，RSD为14.75％，计算得到一个“Hardy-Weinberg”平衡群体的值为863株，折算成一次最小投料量约为11.22kg。
　　6.基于鱼腥草挥发油气相指纹图谱信息熵的平衡群体研究:运用信息熵及遗传统计学原理，以同一GAP产地鱼腥草植株间挥发油GC指纹图谱信息量变异系数为枢纽，建立中药稳态提取工艺中平衡群体的数学模型，并进行实验验证，结果发现，获得该产地的遗传平衡群体为29683株，折算成一次最小投料量约为118.7kg。
　　本文从鱼腥草挥发油的指纹图谱的变异性、鱼腥草总蛋白的差异性和鱼腥草的RAPD和ISSR的基因多态性等三个角度揭示了鱼腥草植株间存在生物遗传多样性规律;同时将RAPD、ISSR和挥发油气相指纹图谱的信息量与信息熵原理相结合，运用统计学原理，建立相关数学模型，通过实验求算出三个批次的鱼腥草的“Hardy-Weinberg”平衡群体分别为287株、863株、29683株。由结果可知，所得三个不同批次的平衡群体值有很大的差异，究其原因可能有两种:一是内因，不同批次，不同环境平衡群体数值应该会不同;二是测算的角度不同，中药多态性有多种表达形式，不同的表现形式会测算出不同的平衡群体值，最终要经过实验验证、以及临床疗效检验。才能真正实现完全控制中药质量的稳定性，使得中药材“一次投料量”理论可行性、科学性。

目录

摘要

第一章 前言

1．中药材质量及稳定性控制方法国内外研究现状

2．沿用西药“5P质控模式”难以满足中药材质量稳定性控制

3．生物遗传多样性内因决定中药材个体(各植株)间存在质量差异性

4．从DNA、蛋白质、有效成分三个方面揭示中药材植株间的多样性

5．借鉴“Hardy-Weinberg”定律解决中药材植株间的多样性

6．运用信息熵原理测算“Hardy-Weinberg”平衡群体

7．鱼腥草的研究进展

8．本论文的研究目的意义

第二章 鱼腥草植株间遗传多样性研究

第一节 鱼腥草植株间DNA多态性研究

1．材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第二节 鱼腥草植株间蛋白质多样性研究

1．材料与方法

2．结果与分析

3 讨论

第三节 鱼腥草植株间挥发性油指纹图谱多样性研究

1．材料与方法

2．结果与分析

3 讨论

第三章 测算Hardy-Weinberg平衡群体的数学模型的建立

1．基于中药指纹图谱所携带信息量的平衡群体的数学模型的建立

2．基于RAPD、ISSR扩增条带所承载信息量的平衡群体数学模型的建立

第四章 映射Hardy-weinberg平衡群体的一次投料量值研究

第一节 基于鱼腥草RAPD扩增条带信息熵的平衡群体研究

1．材料与方法

2．结果与分析

3 讨论

第二节 基于鱼腥草ISSR扩增条带信息熵的平衡群体研究

1．材料与方法

2．结果与分析

3．讨论

第三节 基于鱼腥草指纹图谱信息熵的平衡群体研究

1．材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第五章 “一次最小投料量”理论的验证实验研究

1．材料与方法

2．结果分析

3．讨论

第六章 结论与展望

1．结论

2．展望

参考文献

附录一：在读期间发表的主要论文

附录二．缩略词表

附录三．多态性分析扩增结果

致谢

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