斑马鱼心脏发育候选基因HPRG1相关品系的建立及初步功能研究

摘要

心脏是脊椎动物最早发育并行驶功能的器官之一，其发育过程受到多种基因的表达调控。这些基因的表达异常会导致不同类型的心脏缺陷。在我国约有1000万先天性心脏病患者，这类疾病已上升为人类的头号杀手，因此，研究心脏发育的调控基因，有助于更好地了解心脏病的发病机制以及对该类疾病的防治。斑马鱼作为一种理想的模式动物，具有个体小、易于饲养、发育快、繁殖能力强、体外受精、胚胎体外发育且透明等优点，其基因组与人类的相似性达到了87％，因此使用斑马鱼作为脊椎动物发育生物学模型研究心脏发育的基因调控机制具有极大的优势。
　　本室的前期研究显示，斑马鱼基因HPRG1可能参与心脏早期的形态建成，与Smad蛋白相互作用，通过BMP信号途径在心脏发育中发挥重要的调控作用。本论文以斑马鱼为模型继续研究HPRG1基因在脊椎动物心脏发育中的功能。
　　本论文首先通过整体胚胎原位杂交研究HPRG1基因在斑马鱼胚胎发育中的表达模式。实验结果表明，HPRG1基因在胚胎发育的早期开始表达，在发育晚期定位于心脏组织特异性表达，这与本室前期的胚胎免疫荧光实验结果相符合。其次，本文利用Tol2转座子系统构建了一系列与斑马鱼心脏候选基因HPRG1相关的转基因斑马鱼品系，其中已成功建立的可稳定遗传的品系包括:Tg∶pTol2(cmlc2∶HPRG1-EGFP)、Tg∶pTol2(HPRG1(3kb)∶EGFP)、Tg∶pTol2(HPRG1(2kb):EGFP)、pTol2(HPRG1(1kb):EGFP)。通过对pTol2(cmlc2∶HPRG1-EGFP)过表达品系进行表型分析，发现HPRG1基因在心脏过表达导致围心腔变大、心脏不能正常环化及心室缩小、心房膨大等缺陷表型。利用斑马鱼M-mode生理学研究技术，进一步证明HPRG1基因对心脏生理学功能起着重要的调控作用。对pTol2(HPRG1(3kb)∶EGFP)品系的荧光表达模式分析发现，3kb的启动子限制HPRG1基因在心脏组织特异性表达，其表达模式与之前的原位杂交表达模式相符合。另外，本文还利用Tol2转座子系统建立了pTol2(cmlc2∶CRE-IRES-EGFP)转基因斑马鱼品系。分析表明，该品系在心脏特异性表达CRE重组酶，对心脏的正常发育没有明显影响。该品系的成功建立为利用条件基因打靶技术研究斑马鱼候选基因在心脏发育与相关疾病中的功能奠定了基础。
　　本论文利用近几年兴起的CRISPR/Cas9打靶技术建立斑马鱼HPRG1基因敲除系。首先经网站分析筛选出HPRG1基因最合适的打靶位点，构建出HPRG1基因的左右半位点CRISPR表达载体，转录成RNA并与Cas9核酸内切酶的mRNA相混合，显微注射至斑马鱼单细胞期胚胎。以提取的24hpf胚胎基因组为模板进行PCR扩增和酶切检测，证明该表达载体能有效地诱发基因突变。斑马鱼HPRG1基因的稳定敲除模型正在构建中。

目录

摘要

1 引言和文献综述

1．1 模式生物斑马鱼概述

1．1．1 斑马鱼研究进展简述

1．1．2 斑马鱼胚胎发育过程简述

1．1．3 斑马鱼心脏发育过程简述

1．2 转基因斑马鱼技术

1．2．1 转基因斑马鱼研究进展简述

1．2．2 Tol2转座子系统

1．2．3 CRE／loxP重组酶系统

1．3 CRISPR／Cas9基因打靶技术

1．4 本文研究的意义

2 材料和方法

2．1 材料

2．1．1 主要试剂、抗体和试剂盒

2．1．2 主要溶液

2．1．3 主要实验仪器和耗材

2．2 方法

2．2．1 地高辛标记的RNA探针的合成

2．2．2 斑马鱼整体胚胎原位杂交

2．2．3 高保真PCR扩增目的片段

2．2．4 载体的连接及转化

2．2．5 质粒的小量提取与鉴定

2．2．6 酶切产物的纯化回收

2．2．7 感受态细胞的制备

2．2．8 mRNA的转录合成

2．2．9 mRNA的纯化(RNeasy Mini试剂盒法)

2．2．10 基因组DNA的提取

2．2．11 蛋白的提取

2．2．12 SDS-PAGE蛋白电泳

2．2．13 Western-blot免疫印迹分析

2．2．14 斑马鱼的饲养及显微注射

3 实验结果及其分析

3．1 利用整体胚胎原位杂交分析HPRG1的表达

3．1．1 HPRG1探针合成的结果

3．1．2 HPRG1探针的原位杂交结果

3．2 转基因斑马鱼品系的构建

3．2．1 Tol2转座酶mRNA的制备

3．2．2 pTol2(CMLC2∶HPRG1-EGFP)过表达品系的建立

3．2．3 pTol2(HPRGl(1kb)∶EGFP)品系的构建及鉴定

3．2．4 pTol2(HPRGI(2kb)：EGFP)品系的构建及鉴定

3．2．5 pTol2(HPRGl(3kb)∶EGFP)品系的建立

3．2．6 pTol2(CMLC2∶CRE-IRES-EGFP)品系的建立

3．3 CRISPR／Cas9打靶技术敲除斑马鱼HPRG1基因

3．3．1 CRISPR表达质粒的构建

3．3．2 CRISPR表达质粒的体内活性检测

3．4 验证HPRG1-morpholino的有效性

3．4．1 pCMV-HPRG1-EGFP-N2质粒的构建及鉴定

3．4．2 HPRG1-morpholino的体内活性验证

4 讨论

5 结语

参考文献

附录1：专业名词缩写词简表

附录2：攻读学位期间的学术论文

致谢

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