利用WISH技术研究斑马鱼TMP3和FHLA基因在心脏和骨骼肌发育中的作用

摘要

脊椎动物的心脏是最早出现并表现出功能的器官之一。它的发育过程极其复杂，受到一系列心脏发育相关基因的精确调控。这些基因发生异常将会导致先天性心脏病，严重的将会导致胚胎的死亡。目前对心脏发育过程中牵涉到的分子机制仍然不清楚，因此，研究调控心脏发育候选基因的功能及其作用的分子机制具有重要的理论与临床应用意义。本文以斑马鱼为模式生物，利用原位杂交技术研究了TMP3对心脏发育及FHLA对骨骼肌发育的作用。
　　TMP3在心脏和肌肉中特异性高表达，其是否影响心脏的发育尚不得而知。本文以斑马鱼为模型，利用整体胚胎原位杂交技术(WISH)对其在心脏发育中的功能进行了研究。我们首先用报告基因EGFP为探针，在斑马鱼TMP3-enhancer品系中做原位杂交，得到了TMP3基因的胚胎表达谱。接着以心房标记基因amhc为探针，在斑马鱼胚胎发育22ss，24hpf和48hpf阶段做原位杂交，结果显示:敲低TMP3导致心房变小，共注射TMP3 mRNA能拯救TMP3敲低导致的心房变小表型。由于我室证明TMPA4是TMP3相互作用蛋白，我们对TMPA4进行了Morpholino敲低研究，结果发现敲低TMPA4导致与TMP3相似的心房变小的心脏畸形，共注射TMPA4 mRNA能拯救TMPA4敲低导致的心房变小表型。我室也证明GATA4是TMP3的直接靶基因。我们以GATA4为探针对5ss胚胎发育阶段的原位杂交结果显示:过表达GATA4也能拯救单敲低TMP3、TMPA4以及共敲低TMP3和TMPA4引起的GATA4表达下调的表型。进一步分别用心脏标记基因cmlc2，心室标记基因vmhc和心房标记基因amhc标志为探针进行分析的结果显示:GATA4确实能拯救单敲低TMP3和TMPA4以及共敲低TMP3和TMPA4导致的心脏变小的表型。
　　人类FHL1基因与骨骼肌疾病的发生相关。斑马鱼FHLA基因是其同源基因，其是否影响骨骼肌的发育未知。我们首先合成了FHLA探针，在斑马鱼中做原位杂交，本文结果显示，在体节发育时期，FHLA在骨骼肌特异表达。敲低FHLA将会导致骨骼肌的发育出现异常。注射FHLA mRNA能够拯救该缺陷表型。那么，骨骼肌的异常是否是由慢肌发育异常引起的呢？于是，我们用用F59和4D9抗体做胚胎抗体染色，结果显示:FHLA是慢肌发育所必需的，但不影响慢肌前体细胞。因为卫星细胞是出生后动物骨骼肌生长和再生的主要细胞来源，而pax7在卫星细胞系的特化过程中是必不可少的，因此我们用pax7抗体做了胚胎抗体染色，结果显示FHLA影响卫星细胞的发育。最后，我们的结果还显示RA信号能够调控内源性FHLA的表达，并且，在肌肉发育过程中，FHLA和RA信号引起相似的表型。这提示FHLA可能通过RA信号调控骨骼肌的发育。总之，我们的结果显示，FHLA是调控卫星细胞数目以及骨骼肌发育所必需的。

目录

摘要

1 引言

1．1 斑马鱼心脏发育概论

1．1．1 斑马鱼作为模式生物的优点

1．1．2 斑马鱼心脏发育过程

1．2 斑马鱼心脏早期发育的基因调控

1．3 骨骼肌发育的分子机制

1．3．1 骨骼肌发育的基因调控

1．4 相关标记基因

1．4．1 amhc

1．4．2 vmhc

1．4．3 cmlc2

1．4．4 vmhc

1．5 FHLA基因背景介绍

1．6 本文研究的目标与研究意义

2 材料和方法

2．1 材料、试剂与设备

2．1．1 酶类、试剂盒以及抗体

2．1．2 菌株和质粒

2．1．3 其他试剂

2．1．4 主要实验仪器

2．1．5 生物信息学分析的主要软件与数据库

2．2 常规分子生物学实验方法

2．2．1 分子克隆

2．2．2 Anti-sense RNA的转录及探针合成

2．2．3 总RNA的提取

2．2．4 斑马鱼morpholino技术

2．2．5 斑马鱼整体胚胎原位杂交(WISH)

2．2．6 斑马鱼整体胚胎抗体染色

2．2．7 统计数据

3 结果

3．1 斑马鱼原位杂交探针的制备

3．1．1 vmhc，amhc探针的制备

3．1．2 my17探针合成的结果

3．1．3 GATA4探针的合成

3．1．4 EGFP探针的合成

3．1．5 skMLCK探针的合成

3．1．6 MyoD探针的合成

3．2 斑马鱼TMP3在心脏发育中的作用研究

3．2．1 TMP3基因的表达谱分析

3．2．2 TMP3基因对斑马鱼心脏和心室发育的影响

3．2．3 TMP3对斑马鱼心房发育的影响

3．2．4 TMP3相互作用基因TMPA4对斑马鱼心脏和心室发育的影响

3．2．5 TMP3相互作用基因TMPA4对斑马鱼心房发育的影响

3．2．6 TMP3的下游直接靶基因GATA4的拯救实验结果

3．3 斑马鱼FHLA基因在骨骼肌发育中的功能研究

3．3．1 FHLA在斑马鱼骨骼肌的表达谱分析

3．3．2 FHLA对斑马鱼骨骼和肌纤维的影响

3．3．3 FHLA对骨骼肌发育的影响

3．3．4 FHLA对斑马鱼慢肌发育的影响

3．3．5 FHLA对卫星细胞发育的影响

3．3．6 RA对斑马鱼骨骼肌发育的影响

4 讨论

5 结论

参考文献

附录

致谢

声明