刺糖多孢菌功能蛋白质组及其多杀菌素产生代谢调控网络的研究

摘要

微生物合成次级代谢产物的生理过程受到细胞中一系列精细、复杂及有序的代谢调控，探究合成途径中的关键调控因子，成为次级代谢产物产生代谢调控网络研究的热点。近年来，微生物次级代谢产物产生代谢调控网络的研究逐步与蛋白质组学研究相结合，蛋白质组学技术被广泛用于鉴定和监测微生物蛋白质组中的蛋白质种类及其表达丰度的变化趋势，挖掘次级代谢产物合成过程中的潜在调控因子，获取其代谢调控网络信息。
　　放线菌刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa）是一种能产生以多杀菌素为主要次级代谢产物的革兰阳性菌，经有氧发酵产生的大环内酯类次级代谢产物多杀菌素能有效杀灭多种农业害虫。目前，虽然催化多杀菌素生物合成的基因簇及其生物合成代谢通路的相关研究取得进展，但是与其合成相关的代谢调控通路的研究报道较少。为了探索多杀菌素生物合成过程中的潜在调控因子和调控机制，本研究对刺糖多孢菌CCTCC M206084菌株不同生长时期的蛋白质组进行了系统的比较分析。利用二维液质联用质谱(Two-dimensional-liquidchromatography-tandem mass spectrometry，2D-LC-MS/MS)分别从对数生长期(T1)、稳定期前期(T2)、稳定期后期(T3)和衰亡期(T4)鉴定到1090、1166、701和509种蛋白质。在这些鉴定到的蛋白质中，1579种蛋白质特异性的属于刺糖多孢菌蛋白质组中。其中，几乎所有参与多杀菌素生物合成的酶类都被鉴定到。利用PAI值分析了蛋白质在不同生长时期的表达丰度变化趋势，发现一系列压力响应蛋白和潜在的全局性调控因子在多杀菌素的合成过程中表达丰度差异显著。随后，利用qRT-PCR技术分析了glnA、metE、spnK、psda和cndp等基因在不同生长时期的转录水平，显示所选择的目的基因在转录水平和翻译水平上的差异具有正相关关系。本研究首次系统性地分析了刺糖多孢菌发酵过程中蛋白质组的变化，其蛋白质组学数据为多杀菌素合成代谢调控网络的研究奠定了基础。
　　对潜在调控基因进行阻断，观察突变菌株相对于原始菌株所体现的表型差异，是研究该基因生物学功能的重要手段之一。钴胺素非依赖型甲硫氨酸合成酶(Cobalamin-independent methionine synthase，MetE)是催化甲硫氨酸生物合成最后一个步骤的关键酶。在前期的功能蛋白质组学研究工作中，发现MetE在刺糖多孢菌中的表达丰度随着发酵过程中多杀菌素的累积而显著上调，推测该酶除了直接参与甲硫氨酸的合成外，对于多杀菌素的生物合成可能具有正调控作用。为了探究MetE的对于多杀菌素生物合成的重要性，本研究利用单交换同源重组的方法对MetE蛋白的编码基因metE进行阻断，成功获得了ΔmetE突变菌株。与野生型刺糖多孢菌相比，ΔmetE突变菌株在液体发酵培养基和固体平板上都体现出较快的生长速率;在液体发酵培养基中，ΔmetE突变菌株不再同野生型刺糖多孢菌一样具有两次生长的特性，只具有一个较长的稳定生长期;ΔmetE突变菌株仅产生少量的多杀菌素，其产量相较于野生型刺糖多孢菌下降幅度超过95％;在TSB固体培养基上，野生型刺糖多孢菌能产生白色的孢子，而ΔmetE突变菌株丧失了产孢子的能力。因此，推测metE基因的阻断引起了刺糖多孢菌新陈代谢的较大紊乱，影响了多杀菌素的生物合成和孢子的生长发育。
　　利用比较蛋白质组学分析目的基因突变菌株与野生型菌株蛋白质组表达图谱的差异，可以探究目的功能基因所控制和影响的调控路径或代谢通路，阐明所阻断目的基因的重要生物学功能及代谢调控机制。为了剖析刺糖多孢菌对metE基因阻断后所体现的新陈代谢适应机制，本研究利用无标记定量蛋白质组学技术分析了ΔmetE突变菌株和野生型菌株的蛋白质组差异。从ΔmetE突变菌株的稳定期初期(S1△metE，67 h)、野生型菌株的第一个稳定期(S1WT，67 h)和第二个稳定期(S2WT，100h)中分别鉴定到1141、1066和987种蛋白质，共检测到刺糖多孢菌蛋白质组中1440种蛋白质。利用emPAI值对所鉴定到的蛋白质进行半定量分析，以野生型刺糖多孢菌的两组蛋白质组样本为参照，重点关注蛋白质表达丰度在比较组S1△metE/S1WT和S1ΔmetE/S2WT中的变化趋势，分析了ΔmetE突变菌株与野生型刺糖多孢菌的蛋白质组差异。结果显示，大部分具有显著上下调趋势的蛋白质属于初级代谢和基因信息过程功能类别。同时，详细阐述了参与葡萄糖代谢和氨基酸代谢（甲硫氨酸、天冬氨酸和谷氨酸）酶类所体现的复杂代谢适应机制。本研究首次说明MetE不仅是直接参与甲硫氨酸合成的酶，也对刺糖多孢菌的全局性代谢调控具有重要影响。
　　综上所述，本文对刺糖多孢菌不同生长时期的功能蛋白质组进行了比较分析;研究了metE基因阻断后对刺糖多孢菌表型和生长特性的影响;利用蛋白质组学技术剖析了刺糖多孢菌对metE基因阻断的新陈代谢适应机制。研究结果为进一步阐明刺糖多孢菌产多杀菌素的代谢调控网络奠定了基础，也彰显了蛋白质组学技术在微生物次级代谢产物合成调控机制研究中的重要地位。

目录

摘要

第一章 绪论

1．1 微生物次级代谢产物代谢调控的研究

1．1．1 放线菌次级代谢产物代谢调控研究的策略

1．1．2 多杀菌素产生代谢调控网络的研究进展

1．2 蛋白质组学在微生物次级代谢产物代谢调控研究中的应用

1．2．1 蛋白质组学的主要研究技术

1．2．2 蛋白质组学在次级代谢产物合成调控研究中的应用

1．3 立题依据和意义

1．4 研究技术路线

第二章 刺糖多孢菌不同生长发育时期蛋白质组研究

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．2．1 菌株及培养条件

2．2．2 生理特性的研究

2．2．3 全菌体蛋白质的提取及SDS-PAGE检测

2．2．4 蛋白质的胰蛋白酶酶解

2．2．5 质谱鉴定酶解肽段

2．2．6 蛋白质数据库搜索

2．2．7 Label-free半定量分析蛋白质表达丰度差异

2．2．8 qRT-PCR检测

2．3 结果与分析

2．3．1 刺糖多孢菌生长特性分析

2．3．2 刺糖多孢菌功能蛋白质组

2．3．3 生长过程的压力响应和氧化还原平衡

2．3．4 初级代谢

2．3．5 全局性调控因子

2．3．6 多杀菌素的生物合成

2．3．7 qRT-PCR验证

2．4 讨论

第三章 突变菌株S．spinosa A△metE的构建及其生理特性

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 菌株及培养条件

3．2．2 metE基因的克隆及载体pOJ260-metE的构建

3．2．3 接合转移及突变菌株S．spinosa △metE的鉴定

3．2．4 生理特性研究

3．3 结果与分析

3．3．1 载体pOJ260-metE的构建及验证

3．3．2 突变株S．spinosa △metE的构建及验证

3．3．3 metE基因阻断后在液体培养基中的生长差异

3．3．4 metE基因敲除后对菌株产孢子情况的影响

3．3．5 接合子的遗传稳定性

3．4 讨论

第四章 蛋白质组学技术剖析S．spinosa对metE基因阻断的新陈代谢适应

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．2．1 菌株及培养条件

4．2．2 蛋白质的提取及SDS-PAGE分析

4．2．3 菌体全蛋白的胰蛋白酶酶解

4．2．4 2D-LC-MS／MS鉴定

4．2．5 数据处理

4．2．6 蛋白质半定量及生物信息学分析

4．2．7 Western blotting鉴定

4．3 结果与分析

4．3．1 全局性比较蛋白质组学分析

4．3．2 功能分类

4．3．3 糖酵解与TCA

4．3．4 磷酸戊糖途径及ED途径

4．3．5 糖异生作用

4．3．6 谷氨酸和天冬氨酸代谢

4．3．7 甲硫氨酸代谢及SAM循环

4．3．8 Western blotting验证

4．4 讨论

第五章 研究结论与展望

5．1 主要研究结论

5．2 展望

参考文献

附录

论文发表情况

致谢

本论文感谢以下基金项目的资助

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