白额巨蟹蛛毒液的生理生化研究

摘要

白额巨蟹蛛是广泛分布在世界各地的一种以捕食昆虫为生的蜘蛛。通过对毒液进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验，除鉴定到大量多肽外，我们还鉴定到了其蛋白成分主要集中于35 kDa，50 kDa,70kDa等区域。除此之外，我们运用反相高效液相色谱技术和基质辅助激光解吸附飞行时间质谱技术，在蜘蛛粗毒中检测到了164个峰，去掉重复出现的峰，我们从白额巨蟹蛛毒液中鉴定到了137种分子量不同的多肽成分，这显示了白额巨蟹蛛毒液中毒素多肽的巨大多样性。实验结果显示该毒液中的多肽呈现单峰分布，大约90％的多肽分布在3000-4500 Da的范围内，而这种分布与很多目前已经鉴定到的蜘蛛多肽毒素的典型双峰分布不同。
　　通过膜片钳实验技术，我们发现白额巨蟹蛛毒液对美洲大蠊中枢神经系统背侧不成对中间神经元(DUM)上的钠离子通道电流有强烈的抑制作用，其IC50值为6.25±0.02μg/mL(n=5)。100μg/mL能够完全抑制美洲大蠊中枢神经系统背侧不成对中间神经元上的钠电流，但对大鼠背根神经节上的电压门控钠通道电流仅能抑制27.0％±3.7％(n=5)。10μg/mL毒液使DUM细胞上的最大电流的激活电压向去极化方向漂移了10 mV，但没有改变通道的激活和反转电压。美洲大蠊胸腔注射毒液的急性毒性实验表明:低剂量的白额巨蟹蛛粗毒能够使美洲大蠊产生弛缓性瘫痪，无力以及运动失调等一系列神经毒症状，高剂量的白额巨蟹蛛粗毒能够使美洲大蠊致死，其半致死剂量为28.18μg/g。
　　本研究的第二部分内容是研究了从白额巨蟹蛛毒液中分离纯化的HpTx-Ⅰ与电压门控钠通道亚型1.7的相互作用。MALDI-TOF\TOF质谱鉴定相对分子质量为3921.5425 Da; HpTx-Ⅰ序列全长为33个氨基酸残基，经过对二级质谱结果分析并进行搜库比对测得HpTx-Ⅰ的序列为DCGTIWHYCGTDQSECCEGWKCSRQLCKYVIDW。通过膜片钳实验我们检测了该毒素多肽对四种钠通道亚型的影响，这个多肽对钠通道亚型1.7作用最强(IC50=0.282±0.035μM)，与rNav1.3和rNav1.4相比作用效果要强20倍，对hNav1.5作用较强(IC50=1.54±0.12μM)。实验结果表明HpTx-Ⅰ虽然能抑制hNav1.7通道电流失活，但是对其通道的稳态失活并没有产生影响。0.5μM HpTx-Ⅰ毒素处理细胞能使hNav1.7通道的最大峰电流的激活电压向去极化方向漂移了约10 mV，但是对通道的起始激活电压以及通道的翻转电位并没有产生影响，说明当HpTx-Ⅰ处理细胞后使hNav1.7通道电流不易被激活。在检测的异源表达的Nav1.8与Nav1.5的嵌合体中，5μM HpTx-Ⅰ毒素对其峰电流没有抑制作用。

目录

摘要

第一章 蜘蛛毒素与电压门控钠离子通道的研究进展

1．1 哺乳动物电压门控钠通道及其相互作用的毒素

1．1．1 电压门控钠通道的概述

1．1．2 电压门控钠通道的分子结构

1．1．3 电压门控钠通道与神经病理性疼痛

1．1．4 电压门控钠通道与多肽毒素

1．2 昆虫动物电压门控钠通道及其相互作用的毒素

1．2．1 昆虫电压门控钠通道的概述

1．2．2 昆虫电压门控钠通道的分子结构

1．2．3 昆虫电压门控钠通道与杀虫剂开发

1．3 本研究的背景及意义

2．1 前言

2．2 材料和仪器

2．2．1 实验材料

2．2．2 实验试剂

2．2．3 实验仪器

2．3 实验方法

2．3．1 白额巨蟹蛛毒液的多肽和蛋白分析

2．3．2 白额巨蟹蛛毒液的分离纯化

2．3．3 白额巨蟹蛛毒液的质谱分析

2．3．4 白额巨蟹蛛毒素的多样性分析

2．3．5 美洲大蠊DUM神经元的急性分离

2．3．6 大鼠背根神经节DRG细胞急性分离

2．3．7 全细胞模式膜片钳电生理活性检测

2．3．8 加药物

2．3．9 白额巨蟹蛛毒液对美洲大蠊和大鼠的神经毒活性以及致死性分析

2．4 实验结果

2．4．1 白额巨蟹蛛毒液的分离纯化和质谱鉴定

2．4．2 白额巨蟹蛛毒素的分子多样性

2．4．3 白额巨蟹蛛毒液对电压门控钠通道活性的影响

2．4．4 白额巨蟹蛛毒液对美洲大蠊的毒性实验

2．5 结论与进一步研究设想

第三章 HpTx-I对钠通道的影响

3．1 前言

3．2 材料、试剂和仪器

3．2．1 实验材料

3．2．2 实验试剂

3．2．3 实验仪器

3．3 实验方法

3．3．1 HpTx-I的分离纯化和质谱鉴定

3．3．2 细胞的冻存和复苏

3．3．3 细胞传代培养

3．3．4 转化反应

3．3．5 质粒的提取

3．3．6 细胞转染

3．3．7 电生理实验检测

3．4 实验结果

3．4．1 HpTx-I的分离纯化及质谱鉴定

3．4．2 HpTx-I作用于电压门控钠离子通道的活性分析

3．5 结论与进一步研究设想

参考文献

缩写表(中英文对照)

附表

论文发表

致谢

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