纳米基因载体酶切保护机理的研究及新型基因载体的制备与应用

摘要

无论是在基因表达调控与基因功能等基础研究方面，还是在以基因作为药物进行临床疾病的治疗即基因治疗方面，基因载体都具有非常重要的作用。无机纳米颗粒类非病毒型基因载体因其稳定性好、生物亲和性好、安全、有效、无免疫原性等优点，已引起广泛关注。但是人们对此类基因载体在基因传递过程中的各种关键因素还缺乏深入的了解，而且其转染效率普遍不高。本论文针对上述问题开展研究，取得了如下进展： (1)深入研究了氨基化二氧化硅纳米颗粒基因载体的酶切保护机理。 外源基因在细胞内的酶切保护问题是影响基因转染成败的重要因素之一。氨基化二氧化硅纳米颗粒作为新型的非病毒型基因载体，其酶切保护效应已有大量报道，但目前缺乏深入研究。本文以氨基化二氧化硅微米颗粒为对照，从酶反应环境以及结合的DNA链长的角度，研究了氨基化二氧化硅纳米颗粒基因载体的酶切保护机理，得到如下结论：相比于氨基化二氧化硅微米颗粒，氨基化二氧化硅纳米颗粒对结合的DNA在所有的酶切反应中均表现出更优良的酶切保护效应。该结论为纳米基因载体的发展提供了有益的理论支持。 (2)发展了两种基于二氧化硅微颗粒的基因转染新方法。 本文以粒径为几百纳米大小的二氧化硅微颗粒为基础，发展了两种基因转染新方法。其一是将二氧化硅微颗粒与多聚赖氨酸通过静电结合制备出多聚赖氨酸-二氧化硅微颗粒复合物作为基因载体，进行基因转染；其二是在多聚赖氨酸介导的基因转染中加入二氧化硅微颗粒作为转染伴侣，进行基因转染。这两种基因转染方法均快速、简便而且转染效率高(后者在转染效率上更胜一筹)，在基因功能研究以及相关基因工程研究中具有重要的应用前景。 (3)发展了一种基于微乳液体系制备低团聚的针状羟基磷灰石颗粒的新方法，并成功地开展了其在基因转染中的应用。 羟基磷灰石是一种极有应用前景的材料，其制备工艺也颇受关注。传统的液相沉淀法应用广泛，但制备的颗粒易产生团聚，分散性差。本文从改变反应体系的角度对传统方法加以改进，发展了一种基于微乳液体系进行化学沉淀制备针状羟基磷灰石颗粒的新方法。新方法不仅保留了传统方法的优点，还有效改善了颗粒的团聚问题，获得了低团聚的针状羟基磷灰石颗粒。由新方法制备的颗粒分散性好，较传统方法制备的颗粒性能更优。不仅表面结合DNA能力明显增强，具有更好的吸附和承载能力，在抗菌剂以及药物等载体方面的应用占有优势，而且细胞相容性也明显增强，有助于其在生物医学中的深入应用。此外，由新方法制备的颗粒在转染效率上也有所提高。

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第1章绪论

1.1非病毒型基因载体的发展简史

1.2非病毒型基因载体介导基因转染的一般过程

1.3基于有机材料的非病毒型基因载体

1.3.1阳离子脂质体

1.3.2阳离子多聚物

1.3.3天然高分子

1.4基于无机纳米颗粒的非病毒型基因载体

1.4.1磷酸钙纳米颗粒

1.4.2羟基磷灰石纳米颗粒

1.4.3阳离子修饰的二氧化硅纳米颗粒

1.4.4功能化的金纳米颗粒

1.4.5氧化铁磁性生物纳米颗粒

1.4.6复合纳米金属棒

1.5本论文拟开展的工作

第2章氨基化二氧化硅纳米颗粒基因载体的酶切保护机理的研究

2.1前言

2.2实验部分

2.2.1试剂及仪器

2.2.2实验方法

2.3结果与讨论

2.3.1 NH2-NPs的表征

2.3.2质粒DNA的酶切检测

2.3.3 NH2-NPs与质粒DNA的结合及解离分析

2.3.4 NH2-NPs对质粒DNA的限制性内切酶酶切保护分析

2.3.5 NH2-NPs对寡核苷酸链的Dnase I酶切保护分析

2.3.6 NH2-NPs对质粒DNA的血清降解保护分析

2.3.7 NH2-NPs的DNA酶切保护的机理分析

2.4小结

第3章基于二氧化硅微颗粒的基因转染新方法

3.1前言

3.2实验部分

3.2.1试剂及仪器

3.2.2实验方法

3.3结果与讨论

3.3.1二氧化硅微颗粒的表征

3.3.2二氧化硅微颗粒在基因转染中的应用

3.4小结

第4章基于微乳液体系的低团聚的针状羟基磷灰石颗粒的制备及其在基因转染中的应用

4.1前言

4.2实验部分

4.2.1实验原理

4.2.2试剂及仪器

4.2.3实验方法

4.3结果与讨论

4.3.1羟基磷灰石颗粒的性能表征

4.3.2羟基磷灰石颗粒的细胞相容性研究

4.3.3羟基磷灰石颗粒与DNA的结合分析

4.3.4羟基磷灰石颗粒结合的DNA的解离分析

4.3.5羟基磷灰石颗粒在基因转染中的应用

4.4小结

结论

参考文献

致谢

附录 攻读学位期间所发表的学术论文目录