功能化核壳型复合纳米颗粒的制备及其在生物医学研究中的应用

摘要

复合纳米颗粒，尤其是核壳型复合纳米颗粒，克服了普通单组分纳米颗粒物质组成单一的不足，将不同物质所拥有的多种功能有机地结合在一起，显示出普通单组分纳米颗粒无可比拟的优越的理化性能，成为目前研究的热点。而且核壳型复合纳米颗粒在生化检测、医学成像、生物物质分离等生物医学领域显示出了广阔的应用前景。本论文瞄准这一重要的研究方向，在对当前迅速发展的复合纳米颗粒进行简要综述的基础上，以几种复合纳米颗粒的制备、性能表征及其在生物医学领域中的应用为主线，主要开展了以下几个方面的研究工作： 一、生物功能化硅壳复合纳米颗粒结合PCR技术用于SARS病毒基因检测。 在本研究小组硅壳复合纳米颗粒技术平台的基础上，发展了一种将生物功能化硅壳磁性复合纳米颗粒(SMNPs)和硅壳荧光复合纳米颗粒(SFNPs)与PCR技术相结合来检测SARS病毒基因的新方法。我们首先利用修饰了捕获探针的硅壳磁性复合纳米颗粒对目标cDNA进行纯化和富集，然后对纯化的目标进行对称PCR扩增，接着再次利用修饰了捕获探针的硅壳磁性复合纳米颗粒将PCR扩增中产生的目标cDNA的互补链除去，最后以修饰了报告探针的硅壳荧光复合纳米颗粒通过三明治核酸杂交方式对扩增的目标cDNA进行定量检测。研究结果表明，该方法能成功地检测到目标cDNA，检测限达到2x103 copy/mL，整个检测程序可以在6个小时内完成。该方法利用硅壳磁性复合纳米颗粒来纯化和富集DNA目标链，降低了普通PCR方法在检测SARS病毒基因时所存在的假阳性和假阴性问题；同时，这种以硅壳荧光复合纳米颗粒为检测信号采用三明治杂交方式检测PCR产物的方法同时具备荧光纳米颗粒的高灵敏度和核酸杂交技术的特异性，有效解决了电泳和同位素标记等方法带来的安全隐患问题，结果直观、特异性强、灵敏度高，是一种具有潜力的核酸检测方法。 二、Fe3O4@SiO2@Au核壳型复合纳米颗粒的制备及其在基因转染和细胞识别中的应用。 在硅壳磁性纳米颗粒的基础上，以Fe3O4@SiO2纳米颗粒为内核材料，采用自组装和化学还原法进一步对其进行包壳，构建了一种新型的Fe3O4@SiO2@Au核壳型复合纳米颗粒。对这种新型的核壳型复合纳米颗粒进行透射电镜、动态光散射、能谱表征的结果表明，该颗粒兼具磁性和金的表面特性及光谱特性，粒径为120±11 nm，并且具有较好的分散性。细胞毒性测定的研究结果也表明这种纳米颗粒具有很好的生物亲和性。在进一步探讨Fe3O4@SiO2@Au核壳型复合纳米颗粒在基因转染和细胞识别方面的应用中发现，该种纳米颗粒在多聚赖氨酸的协助下可以成功介导基因转染，并且偶联上RGD肽后还可以对乳腺癌细胞进行很好的识别。这种金包覆的核壳型复合磁性纳米颗粒可望在生物医药、细胞分离、DNA检测等领域具有较好的应用前景。 三、Fe3O4@Ag复合纳米颗粒的制备及其抑菌效果研究。 利用反相微乳液法制备了一种既具有磁性又具有抑菌效果的双功能Fe3O4@Ag复合纳米颗粒。这种纳米颗粒由具有超顺磁性的Fe3O4内核和单质银外壳组成，大小均匀，尺寸在60 nm左右，分散性好，在pH中性的溶液中Zata电势为20.5 mV。Fe3O4@Ag复合纳米颗粒的抑菌性能测定结果表明，该种纳米颗粒对大肠杆菌、葡萄球菌、枯草杆菌等革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和孢子菌的代表性细菌都具有很好的抑菌功能。同时，利用其超顺磁性，可以非常容易地将发挥杀菌作用后的纳米颗粒从水溶液中回收，使处理水达到银残留标准。而且这种已经发挥过杀菌功能的回收颗粒依旧具有一定的抑菌功能，可以回收再利用。这种Fe3O4@Ag复合纳米颗粒制备方法相对简单、理化性能稳定，抑菌效果好，有望发展成为一种水的抑菌剂。 四、紫杉醇脂质体复合纳米颗粒的制备及其细胞靶向药效研究。 通过超声薄膜法制备了一种可连接靶向配体的紫杉醇脂质体复合纳米颗粒。这种载药脂质体纳米颗粒主体是由磷脂双层膜构成的大单室中空小球，不溶于水的紫杉醇药物被包裹在磷脂双分子疏水层中间，其中脂双层中参杂有PEG化的磷脂和二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-对硝基苯碳酸酯(DPPE-PEG-pNP)。部分磷脂的PEG化使得脂质体在体内将具有长循环特性，增加了药物的肿瘤内选择性滞留(EPR)效应。DPPE-PEG-pNP在相对温和的条件下进行水解将生物配体分子修饰到纳米颗粒表面从而使脂质体具有生物靶向功能。该脂质体纳米颗粒的粒径均一，分散性和稳定性都比较好，对药物的包封率也比较高。对体外细胞的靶向识别和靶向药效试验证实连接了靶向配体的紫杉醇复合脂质体纳米颗粒能对目标细胞进行靶向识别并具有一定的靶向药效。这种靶向的紫杉醇脂质体复合纳米颗粒有望发展成为一种优良的靶向纳米药物。

目录

文摘

英文文摘

声明

第1章绪论

1.1引言

1.2复合纳米颗粒的分类及结构特点

1.2.1内部混合型复合纳米颗粒

1.2.2核壳型复合纳米颗粒

1.3复合纳米颗粒的制备方法

1.3.1内部混合型复合纳米颗粒的制备

1.3.2核壳型复合纳米颗粒的制备

1.4复合纳米颗粒的生物医学应用

1.4.1复合纳米颗粒在生物分析与检测中的应用

1.4.2复合纳米颗粒在细胞与活体成像中的应用

1.4.3复合纳米颗粒在药物载体中的应用

1.4.4复合纳米颗粒在基因转染中的应用

1.4.5复合纳米颗粒在生物分离与纯化中的应用

1.5本论文构思

第2章生物功能化硅壳复合纳米颗粒结合PCR技术用于SARS病毒基因检测研究

2.1前言

2.2实验部分

2.2.1试剂和仪器

2.2.2硅壳复合纳米颗粒(SNPs)的制备与表征

2.2.3目标cDNA及探针序列设计

2.2.4硅壳复合纳米颗粒的生物功能化

2.2.5 SMNPs-PM分离目标cDNA

2.2.6目标cDNA的PCR扩增

2.2.7 PCR产物的检测

2.3结果与讨论

2.3.1 SFNPs与SMNPs的表征

2.3.2功能化SNPs结在合PCR技术用于SARS病毒基因检测的原理

2.3.3 SMNPs-PM对目标cDNA的纯化与扩增

2.3.4 PCR产物的检测

2.3.5 SFNPs作为荧光检测信号的光稳定性分析

2.4小结

第3章Fe3O4@SiO2@Au核壳型复合纳米颗粒的制备及其在基因转染和细胞识别中的应用

3.1前言

3.2实验部分

3.2.1试剂和仪器

3.2.2 Fe3O4@SiO2@Au核壳型复合纳米颗粒的制备

3.2.3 Fe3O4@SiO2@Au核壳型复合纳米颗粒的表征

3.2.4细胞培养

3.2.5 Fe3O4@SiO2@Au核壳型复合纳米颗粒的细胞毒性试验

3.2.6 Fe3O4@SiO2@Au核壳型复合纳米颗粒在基因转染中的应用

3.2.7 Fe3O4@SiO2@Au核壳型复合纳米颗粒在细胞的识别中的应用

3.3结果与讨论

3.3.1 Fe3O4@SiO2@Au核壳型复合纳米颗粒的制备原理

3.3.2 Fe3O4@SiO2@Au核壳型复合纳米颗粒的表征

3.3.3 Fe3O4@SiO2@Au核壳型复合纳米颗粒的细胞毒性

3.3.4 Fe3O4@SiO2@Au核壳型复合纳米颗粒应用于基因转染的效果

3.3.5 RGD肽修饰的Fe3O4@SiO2@Au核壳型复合纳米颗粒对目标细胞的识别

3.4小结

第4章Fe3O4@Ag复合纳米颗粒的制备及其抑菌效果研究

4.1前言

4.2实验部分

4.2.1试剂和仪器

4.2.2 Fe3O4@Ag复合纳米颗粒的制各

4.2.3 Fe3O4@Ag复合纳米颗粒的表征

4.2.4 Fe3O4@Ag复合纳米颗粒抗菌性能测定

4.2.5 Fe3O4@Ag复合纳米颗粒抑菌动力学曲线测定

4.2.6 Fe3O4@Ag复合纳米颗粒处理后水中银的残留量测定

4.2.7回收纳米颗粒的抗菌性能测定

4.3结果与讨论

4.3.1 Fe3O4@Ag复合纳米颗粒的表征结果

4.3.2 Fe3O4@Ag复合纳米颗粒的抗菌性能

4.3.3 Fe3O@4Ag复合纳米颗粒处理后水中残留银的含量分析

4.3.4回收纳米颗粒的抗菌性能

4.4小结

第5章紫杉醇脂质体复合纳米颗粒的制备及其细胞靶向药效研究

5.1前言

5.2实验部分

5.2.1试剂及仪器

5.2.2材料的合成

5.2.3脂质体复合纳米颗粒的制备

5.2.4紫杉醇脂质体复合纳米颗粒的表征

5.2.6脂质体复合纳米颗粒的生物修饰

5.2.7脂质体复合纳米颗粒的细胞识别试验

5.2.8紫杉醇脂质体复合纳米颗粒对细胞的靶向抑制试验

5.3结果与讨论

5.3.1 PEG-(pNP)2的NMR表征

5.3.2紫杉醇脂质体复合纳米颗粒的结构

5.3.3紫杉醇脂质体复合纳米颗粒的表征结果

5.3.4脂质体复合纳米颗粒对MGC细胞的识别效果

5.3.5紫杉醇脂质体复合纳米颗粒对目标细胞的靶向药效

5.4 小结

结论

参考文献

附录 攻读博士学位期间主要完成的学术论文及专利

致谢