表面活性剂在废木质纤维素制酒精中的应用基础研究

摘要

针对木质纤维素资源生物转化制取酒精技术实用化的一个主要的障碍——纤维素酶活性不高、生产成本过高而导致其应用仍受到限制的问题，本研究首次将由微生物产生的生物表面活性剂鼠李糖脂用于木质纤维素原料制取酒精的几个主要环节，即液态发酵和固态发酵生产纤维素酶、纤维素酶法水解及同步糖化发酵制酒精的过程，目的是为了促进微生物产酶，并进一步提高酶活，从而提高木质纤维素的水解效率和酒精的转化率，并降低成本。同时与化学合成的非离子表面活性剂。Tween 80作了比较。 在液态发酵过程中，加入少量的鼠李糖脂和Tween 80就能对绿色木霉的产酶起到促进作用，尤其在产酶高峰期。添加鼠李糖脂分别使滤纸酶活(FPA)、羧甲基纤维素酶活(CMC酶活)、微晶纤维素酶活最大提高了1.08倍，1.6倍和1.03倍。添加Tween 80也能使酶活增大，效果略逊于鼠李糖脂，并且测得的酶活值整体上均比添加鼠李糖脂的样低。与Tween 80相比，加入鼠李糖脂使溶液的表面张力降得更低，并且在整个发酵过程中都将发酵液的表面张力保持在较低的水平，说明鼠李糖脂不会作为优先降解对象被过早降解，可以在整个发酵过程中发挥作用。 固态发酵过程中添加不同浓度的鼠李糖脂对绿色木霉所产的纤维素酶活和木聚糖酶活有不同程度的促进作用。对纤维素酶系中的三种主要成分，绿色木霉所产的CMC酶活最高，但是表面活性剂对其的影响最小。鼠李糖脂和Tween 80对微晶纤维素酶和纤维二糖酶的促进作用较为明显。另外，与对纤维素酶的影响不同，两种表面活性剂在产酶高峰期对木聚糖酶的影响就很明显。 在纤维素酶促水解的过程中，探讨了添加不同浓度的鼠李糖脂和Tween 80对稻草酶解过程的糖产率、酶稳定性、以及对动力学特征和酶在纤维素上吸附的影响。另外，还采用荧光探针法，以芘为荧光探针，研究了表面活性剂和纤维素酶之间的相互作用。结果表明，表面活性剂有利于增强酶的稳定性，能不同程度地提高反应过程的CMC酶活和FPA，而且对FPA的作用效果更好。加入表面活性剂能提高酶促反应的最大速度和米氏常数，降低了底物与酶的亲和力，提高了纤维素酶的利用效率。表面活性剂能显著减少酶在纤维素上的吸附，从而降低无效吸附酶的数量，增加游离酶与纤维素反应，同时也使纤维素酶更易于回收。另外，通过采用芘作为荧光探针，研究了表面活性剂和纤维素酶之间的作用关系。纤维素酶分子与表面活性剂分子之间有较强的作用力，从而有利于表面活性剂胶团的形成。和鼠李糖脂相比，Tween 80和纤维素酶之间的作用力相对较小，但随着Tween 80的浓度的增大，它和纤维素酶之间的作用力越来越大，尤其在浓度超过临界胶束浓度时。研究在同步糖化发酵反应条件最优的条件下添加表面活性剂的影响，因此，采用响应面法中的中心组合设计来对实验条件进行优化，得到影响同步糖化发酵进行的主要的四个影响因子的最优组合：酶用量为25FPU/gds，底物浓度为2.5％，pH为5.3，反应温度为39℃，其影响显著性为：酶用量>底物浓度>反应温度>pH值。在此条件下，酒精转化率的最大值为78.83％。对得到的回归方程进行方差分析，结果显示方程拟合度高，说明这个实验方法是可靠的。 最后将两种表面活性剂应用在同步糖化发酵纤维素制酒精的过程中，验证了表面活性剂同样能在同步糖化发酵这个复杂的反应体系中起到促进作用。结果显示在反应的最优条件下，分别添加不同浓度的鼠李糖脂和Tween 80，酒精的转化率均有不同程度的提高。提高最大的是反应进行到第72h时，添加lcmc(临界胶束浓度，critical micelle concentration简写为cmc)鼠李糖脂和。rween 80，酒精转化率分别达到84.8％和91.7％，比对照样提高了12.2％和21.3％。 总之，鼠李糖脂和Tween 80都能提高绿色木霉所产的纤维素酶和木聚糖酶的活性，有利于增强酶的稳定性，降低酶和底物的亲和力，减少酶在底物上的无效吸附，提高纤维素酶的利用率。应用在同步糖化发酵过程中，添加表面活性剂在最优的实验条件下仍然能进一步提高酒精的转化率。生物表面活性剂与化学表面活性剂相比具有一些特殊的优点，因此将生物表面活性剂应用于酶的生产及木质纤维素生物转化制酒精有很大的潜力。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：图表目录

声明

第1章绪论

1.1利用木质纤维素原料制乙醇的研究背景

1.2木质纤维素组成及基本结构

1.2.1纤维素

1.2.2半纤维素

1.2.3木质素

1.3纤维素发酵制备乙醇的工艺

1.3.1预处理

1.3.2纤维素水解

1.3.3纤维素发酵

1.3.4后处理

1.4木质纤维素原料制取乙醇的难点

1.5表面活性剂对木质纤维素酶法水解的促进作用

1.6生物表面活性剂的研究现状

1.6.1生物表面活性剂的产生菌及种类

1.6.2生物表面活性剂和化学表面活性剂

1.6.3生物表面活性剂的应用

1.7本研究的目的、意义及主要内容

1.7.1研究的目的

1.7.2研究的意义

1.7.3研究的主要内容

第2章 液态发酵中表面活性剂对绿色木霉产纤维素酶的影响

2.1引言

2.2实验方法和实验设计

2.2.1生物表面活性剂—鼠李糖脂的制备

2.2.2主要试剂的配制

2.2.3测定稻草的组分

2.2.4稻草的元素分析

2.2.5摇瓶产酶实验设计

2.2.6纤维素酶活力的测定

2.2.7表面张力的测定

2.3结果与讨论

2.3.1鼠李糖脂的鉴定结果

2.3.2稻草的成分及元素分析结果

2.3.3发酵过程中表面张力的变化

2.3.4表面活性剂对绿色木霉产酶的影响

2.4本章小结

第3章 固态发酵中表面活性剂对绿色木霉产酶的影响

3.1引言

3.2实验方法和实验设计

3.2.1原料

3.2.2固态发酵实验

3.2.3取样

3.2.4酶液的制取

3.2.5酶活的测定

3.2.6含水率、pH及灰分的测定

3.2.7真菌生物量的测定

3.3结果与讨论

3.3.1固态发酵过程中含水率和pH的变化

3.3.2表面活性剂对纤维素酶的影响

3.3.3表面活性剂对木聚糖酶的影响

3.3.4生物量的变化

3.3.5纤维素和半纤维素含量的变化

3.4本章小节

第4章 鼠李糖脂和Tween 80对稻草酶解的影响

4.1引言

4.2材料与方法

4.2.1材料

4.2.2表面活性剂对稻草酶解的影响

4.2.3表面活性剂对米氏常数和最大反应速度的影响

4.2.4表面活性剂对酶在稻草上吸附的影响

4.2.5表面活性剂和纤维素酶之间的相互作用

4.2.6还原糖的测定方法

4.2.7表面张力的测定

4.2.8稻草中纤维素含量的测定

4.3结果与讨论

4.3.1稻草的预处理

4.3.2酶用量的选择

4.3.3表面活性剂对还原糖产率的影响

4.3.4表面活性剂对酶活的影响

4.3.5表面活性剂对酶解反应纤维素转化率的影响

4.3.6表面活性剂对米氏常数和最大反应速度的影响

4.3.7酶法水解过程中表面张力的变化

4.3.8表面活性剂对纤维素酶在纤维素上吸附的影响

4.3.9表面活性剂和纤维素酶之间的相互作用

4.4本章小结

第5章 响应面法优化利用稻草同步糖化发酵制取酒精的条件

5.1引言

5.2实验材料和方法

5.2.1原料

5.2.2稻草预处理方法

5.2.3菌种

5.2.4培养基

5.2.5复水活化

5.2.6菌悬液的制备

5.2.7扩大培养

5.3同步糖化发酵实验

5.3.1酶液过滤除菌

5.3.2发酵栓

5.3.3蒸馏

5.3.4酒精含量的测定

5.3.5酒精转化率的计算

5.3.6原料的选择和反应时间的选择

5.3.7优化实验设计

5.3.8统计分析

5.4结果与讨论

5.4.1纤维素酶活

5.4.2不同预处理方法的稻草结构和成分分析

5.4.3不同原料和反应时间下的酒精浓度

5.4.4 72h后发酵液中的还原糖浓度

5.4.5回归方程

5.4.6因素的影响和最优值

5.5本章小结

第6章 表面活性剂对稻草同步糖化发酵制取酒精影响

6.1引言

6.2材料和方法

6.2.1原料

6.2.2菌种

6.2.3表面活性剂对同步糖化发酵的影响实验设计

6.2.4酒精含量的测定

6.3结果与讨论

6.3.1表面活性剂对酒精转化率的影响

6.3.2表面活性剂对酒精浓度的影响

6.3.3表面活性剂对还原糖的影响

6.4本章小结

结论

参考文献

附录

致谢