以DNA和蛋白质为探针的固液界面单分子荧光成像研究

摘要

生命科学本质的逐步探索和科学研究对传统分析提出了新的要求。以往常规的分析和检测方法得到的测量结果只是分子群体的平均值，而生命的基本过程取决于细胞内不同分子与同类分子之间的协调作用，因此，欲了解生物过程的化学性质及其运作机制，人们必须在单分子水平对生物分子的化学和物理性质进行深入探索。 单分子检测( Single Molecule Detection，SMD)是一种超灵敏的检测技术，经过二十多年的发展，单分子单细胞检测为揭示物理学、化学，特别是生命运动的规律提供了重要的手段。单分子荧光成像技术是SMD技术中应用最广、获得信息最多的方法之一。 在过去的十几年来，单分子荧光成像技术已经能够成功探测和实时追踪到固。液界面、液-液界面和活细胞内等不同微环境下单个分子的生理特性。固-液界面是DNA和蛋白质等生物大分子在体外研究和应用的最重要的界面之一。通过单分子荧光成像实验可以记录以前未曾实时看到的单个分子的定位、运动轨迹、多聚体形成、动态变化及动力学过程等。这对于探索细胞的活动、阐明生物分子在细胞表面的生物过程、设计新的生物材料、寻找传感器中最佳的基底材料、理解色谱和毛细管电泳的分离机制是很关键的。 基于上述原因，本论文开展了以下三个方面的工作： (1)单分子荧光成像中的图像处理优化研究 图像处理与分析是单分子荧光成像研究的关键性内容。单分子荧光成像的图像处理与图像分析贯穿整个实验过程，但又是一项繁琐而艰巨的任务。免费开源软件Image J软件使用起来方便、快捷，在提高图像分析可靠性的同时，大大节约了数据分析的时间，为单分子荧光成像分析提供了重要的工具。基于此，本章主要研究了Image J软件在识别单个生物大分子的吸附/解吸附事件、计算单分子的吸附个数、测定单个分子的荧光强度和单个分子的漂白步骤(漂白曲线)等方面的应用，重点讨论了单分子荧光成像分析中图像叠加的帧数、二维旋转球法扣除背景中小球半径、粒子计数分析中阈值和单个光斑像素大小的正确选取对单分子吸附个数计算结果可靠性的影响。以单个藻红蛋白分子在界面吸附成像为例，证明了这些参数的选取和优化对单分子荧光成像分析结果可靠性有很大的影响。 (2) DNA在琼脂糖修饰的玻璃表面行为的单分子荧光成像研究 琼脂糖凝胶常用于凝胶电泳中分离和纯化核酸、蛋白质等生物大分子。分离过程中固定相和单个生物分子之间的动态相互作用正是色谱和电泳等生物分离方法最优化的基础。本论文应用物镜型全内反射荧光显微镜，以YOYO-1为探针研究了琼脂糖的表面性质，主要考察了不同的pH值、离子强度和琼脂糖浓度对DNA吸附动力学行为的影响。得出的结论为：DNA分子在琼脂糖表面的吸附量和吸附形式随pH值和离子强度的变化是不同的；DNA在不同浓度琼脂糖表面的吸附行为可归结为静电作用、疏水作用和琼脂糖表面粗糙度三重作用的影响，主导作用是静电作用、疏水作用，琼脂糖表面的构形在某种程度上也影响着DNA的吸附。 (3)巯基乙醇对藻红蛋白单分子行为影响的荧光成像研究 荧光团的光致漂白和闪烁现象严重影响单分子荧光成像研究。在单分子荧光研究中，加入巯基乙醇(2-Mercaptoethanol，BME)可以降低荧光团的漂白速率、减弱闪烁现象，从而提高单分子荧光检测的分辨率和灵敏度。然而，BME对单分子其它行为如吸附和荧光强度的影响并未得到充分研究。本论文应用宽场荧光成像技术，以藻红蛋白( B-phycoerythrin，B-PE)为模型蛋白，从单分子角度系统地研究了BME对蛋白在固-液界面吸附的影响，并对其机理进行了探讨。结果表明：BME浓度的增加可增强B-PE在盖玻片表面的吸附，吸附个数大约可增加到最初的16.0倍，同时也可使其荧光强度增强，但是更高浓度(5.00 mmol/L)的BME可使蛋白部分变性使其吸附个数降低，光斑的平均荧光强度降低；这些结果与荧光光谱的结果相一致。 通过以上研究实现了准确、快速的单分子荧光成像分析，并通过实时观测固-液界面分子的动力学过程，成功研究了影响生物大分子表面吸附机理的基本相互作用，为探测色谱和电泳的分离机制，DNA芯片和生物芯片的制作提供了更加详细的基础理论依据。

目录

文摘

英文文摘

声明

第1章前言

1.1单分子检测的意义

1.2荧光发射的原理

1.3单分子荧光检测的方法

1.3.1宽场落射式荧光显微镜

1.3.2激光扫描共聚焦显微镜

1.3.3全内反射荧光显微镜

1.3.4近场光学扫描显微镜

1.4单分子荧光检测的应用

1.4.1固-液界面生物分子的单分子成像

1.4.2自由溶液中生物分子的单分子成像

1.4.3活细胞内生命活动的单分子成像

1.5单分子荧光检测技术的展望

1.6研究工作的主要意义和内容

第2章单分子荧光成像技术的条件优化和图像处理

2.1引言

2.2实验部分

2.2.1单个B-PE的吸附/解吸附事件的发生

2.2.2单个B-PE吸附个数的计算

2.2.3单个B-PE荧光强度的测定

2.2.4单个B-PE分子的漂白步骤

2.3结果和讨论

2.3.1图像叠加帧数的选择

2.3.2二维旋转球法小球半径的选取

2.3.3阈值的选取

2.3.4单个光斑像素的选择

2.4小结

第3章 DNA在琼脂糖修饰的盖玻片表面行为的单分子荧光成像

3.1引言

3.2实验部分

3.2.1试剂

3.2.2 DNA样品的制备

3.2.3单分子检测实验

3.2.4单分子荧光成像系统参数的设置

3.2.5 CA

3.2.6玻璃片表面的清洗和修饰

3.3结果和讨论

3.3.1盖玻片表面的CA表征

3.3.2单分子荧光成像

3.4小结

第4章 巯基乙醇对藻红蛋白单分子行为影响的荧光成像研究

4.1引言

4.2实验部分

4.2.1试剂

4.2.2仪器设备

4.3结果和讨论

4.3.1 BME对B-PE在盖玻片表面吸附的影响

4.3.2 BME对B-PE荧光强度的影响

4.4小结

结 论

参考文献

附录A攻读学位期间所发表的学术论文目录

致 谢