纳米生物材料在转基因方法优化及荧光标记中的应用研究

摘要

本研究首先针对转基因的特殊要求,制备了壳聚糖纳米颗粒、淀粉纳米颗粒、磁流体等生物纳米材料,并构建了基于生物纳米材料的基因载体,对常见转基因方法进行改进,获得了几种新的转基因方法组合,提高了基因转导的效率,这些组合方法有望在植物转基因应用方面得到使用和推广。其次,合成了以天然高分子为基质的具有磁性分离和双荧光标记功能的双荧光标记磁性淀粉纳米颗粒,并对细胞实时成像和分离分析进行了研究,建立了对转基因细胞的荧光标记和分离分析方法,有望在转基因材料的后续荧光鉴定和分离分析中得到广泛应用。
　　 论文主要研究结果如下:
　　 1.生物纳米材料的制备和表征
　　 利用交联法、油包水(W/O)微乳法和化学沉淀法分别制备了壳聚糖纳米颗粒(chitson nanoparticle,CSNP),淀粉纳米颗粒(starch nanoparticle,StNP)和磁性纳米颗粒,并通过扫描电镜、Zeta电位粒度分析仪等手段对纳米颗粒形貌、大小和分散程度进行表征,琼脂糖凝胶电泳法对纳米颗粒装载DNA情况进行考查。表征结果表明:壳聚糖纳米颗粒呈球形,平均粒径约为50 nm,表面光滑、球形圆整、颗粒比较均匀、分散性好,电位约为11.1 mV;淀粉纳米颗粒经多聚赖氨酸修饰后平均粒径约为50 nm,颗粒呈圆球形,形状规则,分散性好,不团聚,在pH7-8时带正电荷;磁流体纳米颗粒粒径为2～10 nm,呈针状,大小均匀、性能稳定、分散性好。电泳结果表明:制备的纳米颗粒均能有效结合质粒DNA,保护所结合的DNA防止Dnase I的酶切。
　　 2.基于壳聚糖纳米颗粒动物细胞转化体系的建立
　　 以质粒pEGFP为报告基因,以壳聚糖纳米颗粒为载体,利用静电吸附的原理制备得到基因载体复合物,与COS-7细胞共培养,考察了纳米颗粒作为基因载体在动物细胞转基因的转染效果。荧光显微镜检测表明pEGFP在壳聚糖纳米颗粒介导下成功导入COS-7绌胞并合成了绿色荧光蛋白,纳米颗粒与细胞具有良好的生物相容性,作为一种非病毒基因载体,有助于其在生物医学中的深入应用。
　　 3.壳聚糖纳米基因载体与基因枪法联用转基因方法研究
　　 在常规基因枪转基因方法基础上,用纳米颗粒代替金粉或钨粉而与目的基因结合形成基因载体,在基因枪的介导下,转导了洋葱表皮细胞。荧光显微镜观察发现细胞表达了绿色荧光蛋白,壳聚糖纳米颗粒成功将绿色荧光蛋白基因转导进入植物细胞,结果表明在基因枪辅助下,壳聚糖纳米颗粒基因载体可突破植物细胞壁,将目的基因顺利带入细胞内,拓展了壳聚糖纳米颗粒在植物基因表达中的应用。
　　 4.磁性纳米基因载体与电击法联用植物转基因方法研究
　　 针对电击转基因方法中电击过程对裸露DNA的损伤影响,制备了能够保护DNA的磁流体纳米颗粒,通过在电击过程中加入DNA-磁流体复合纳米材料,顺利将目的基因转入水稻细胞中,荧光显微镜观察发现:转化后的悬浮细胞,可以明显看到绿色荧光蛋白在水稻细胞内表达。结果表明纳米颗粒基因载体在电击作用下能有效进入细胞并表达。本方法利用纳米颗粒作为基因载体电击法转化植物细胞获得成功,解决了纳米基因载体通过植物细胞壁的难题。
　　 5.淀粉纳米基因载体与浸花蕾法联用植物转基因方法研究
　　 在常见浸花蕾转基因方法的基础上,淀粉纳米颗粒替代农杆菌,作为月的基因At2g21320的转化载体,通过常规步骤转化,转化得到T0代种子,经bastar筛选后得到抗Bastar的T1代种子,比较T1代种子与野生型种子生长情况。实验发现:突变体株系的开花时间明显早于野生型的,表现出不同程度的矮化,最显著的表现是茎的纵向伸长和叶的发育受到了严重的影响,绿色荧光蛋白在转基因植物的下胚轴细胞中表达。结果表明,淀粉纳米颗粒与浸花蕾法联用成功将目的基因转入植物中,可得到稳定表达的后代植株,联用方法避免了微生物培养的繁琐步骤,具有简便易行的优点,可望成为一种新型转基因方法。
　　 6.复合生物纳米材料的制备及在细胞标记和分离分析研究
　　 针对转基因过程中转基因材料的鉴定和分离分析难点,研究了生物纳米材料在细胞荧光标记和分离分析的应用。经过依次制备磁流体、磁性淀粉纳米颗粒、修饰多聚赖氨酸磁性纳米颗粒和修饰异硫氰酸荧光素和四甲基异硫氰酸罗丹明双标记的磁性纳米颗粒四步制备得到复合生物纳米材料,通过透射电子显微镜、纳米粒度及Zeta电位分析仪、傅里叶红外光谱仪、热分析和磁性分析对制备的复合纳米颗粒进行表征,通过细胞实验对制备纳米颗粒的生物学性能和在细胞标记和分离分析中应用进行考查。表征结果表明:制备的复合纳米微球粒径均匀,分散性好,平均直径约为220 nm,有较好的热稳定性,磁响应明显,抗光漂白性能好。细胞实验结果表明:在低浓度条件下,几乎无细胞毒性:复合纳米颗粒易被细胞吞噬,具有较好的细胞标记功能和磁分离功能。本实验开辟了一种具有多荧光标记功能和磁分离功能的分析技术,可用于细胞的标记分析和分离分析。