高灵敏功能化荧光核酸探针在生化分析中的应用研究

摘要

准确和灵敏地获取生物样品中小分子、核酸、蛋白质和细胞的相关信息对生物医学研究以及临床诊断和治疗都具有十分重要的意义。功能化荧光核酸探针,其功能超出了核酸传统的基因角色,受到广大研究者越来越多的关注,但是,如何获得更高的灵敏度,如何提高抗复杂环境干扰的能力,如何实时、动态、灵敏、准确地获取生命活动相关信息,仍然是分析化学工作者所面临的重大挑战。
　　 本论文瞄准上述挑战进行研究,基于分子识别和信号放大技术发展了一系列分别以小分子、核酸、蛋白质和癌细胞为检测对象的新型功能化荧光核酸探针,主要内容包括:
　　 (1)发展了一种基于荧光共振能量转移和链置换放大技术的核酸适体探针用于小分子可卡因的高灵敏检测。在此,含有核酸适体的发夹探针的3'端标记荧光受体Cy5,而引物的5'端标记荧光供体FAM,当核酸适体与可卡因结合会导致其构型发生变化从而打开发夹结构,引物便可以与打开的发夹探针杂交,在聚合酶作用下引物延伸成与发夹探针序列完全互补,产生新的双链使得供体和受体靠近发生荧光共振能量转移,同时可卡因被引物延伸的链竞争下来变成自由的可卡因分子,又可以与另外一条核酸适体结合,不断循环实现信号放大。该方法可以在16min内达到200nM的检测下限,选择性良好。
　　 (2)发展了一种基于芘激发态二聚体和杂交链式放大技术的核酸探针用于DNA的高灵敏检测。首先对两个发夹探针两端分别进行芘分子标记,由于发夹探针粘性末端的长度使得两端的芘分子以单体形式存在,当目标DNA触发杂交链式反应发生后,会形成一条长的带缺口的双链,使大量的芘分子以二聚体的形式存在。通过稳态荧光分析和时间分辨荧光测量技术可以实现缓冲溶液和复杂生物样品中DNA的高灵敏检测。利用该方法在缓冲溶液中对DNA的检测下限可以达到250 fM。
　　 (3)发展了一种基于芘激发态二聚体和竞争反应的核酸适体探针用于人血清中溶菌酶的高灵敏检测。该体系中含有一条两端标记芘分子的发夹探针和一条未标记的核酸适体:当没有目标分子时,两条链部分杂交可以使发夹探针打开,芘分子以单体形式存在;而当存在目标分子时,目标分子结合核酸适体并以竞争的方式将芘分子双标探针挤开,被挤开的探针呈发夹构型,使得芘分子以二聚体形式存在。我们结合稳态和时间分辨荧光测量技术可对缓冲溶液或血清中的溶菌酶进行检测。该方法在缓冲溶液中对溶菌酶的检测下限可以达到200 pM。利用该方法还实现了ATP的检测,说明这是一种通用的检测方法。
　　 (4)发展了一种基于分子信标和缺刻酶信号放大技术的核酸适体探针用于目标细胞的高灵敏检测。一段能打开分子信标的单链DNA与核酸适体杂交形成核酸适体/单链DNA复合物。当没有靶细胞存在时,单链DNA不能打开分子信标;当有靶细胞存在时,核酸适体与其结合形成核酸适体/靶细胞复合物,导致原来的双链结构分散并将单链DNA释放出来。被释放的单链DNA序列含有缺刻酶的识别位点,当其与分子信标结合以后,缺刻酶会将分子信标切开,单链DNA随即又可以与新的分子信标杂交。以这种方式,每条单链DNA可以多次循环使多个分子信标被切开,从而实现信号放大。利用该方法检测Ramos细胞可以达到200 cells/mL的检测下限,且特异性良好。
　　 (5)发展了一种基于人血管生成素介导进入细胞的核酸适体探针用于增强光动力学治疗的效果。合成并表征了光敏剂Ce6标记的血管生成素核酸适体,与血管生成素特异结合以后,在目标细胞膜表面受体蛋白的介导下进入目标细胞,经过特定波长光照后,Ce6激活周围的氧分子变成单态氧将目标细胞杀死。结果显示该方法具有较高的光动力学的治疗效果。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:本文所用英文缩写词表

第1章 绪论

1.1 基于光学检测的功能化核酸探针

1.1.1 基于光学检测的核酶探针

1.1.2 基于光学检测的核酸适体探针

1.1.3 基于光学检测的核酸适体核酶探针

1.2 核酸探针中的信号放大技术

1.2.1 基于核酸的信号放大技术

1.2.2 基于纳米材料的信号放大技术

1.3 本研究论文的构想

第2章 基于荧光共振能量转移和链置换放大技术的核酸适体探针用于小分子可卡因的高灵敏检测

2.1 前言

2.2 实验部分

2.2.1 试剂与仪器

2.2.2 DNA序列的合成与纯化

2.2.3 荧光信号测量

2.2.4 引物长度的优化

2.2.5 动力学分析

2.2.6 对不同浓度可卡因的响应

2.2.7 选择性分析

2.2.8 聚丙烯酰胺凝胶电泳

2.3 结果与讨论

2.3.1 实验原理

2.3.2 DNA发夹探针和引物的设计

2.3.3 动力学分析

2.3.4 对可卡因分子的检测

2.3.5 选择性分析

2.3.6 凝胶电泳分析

2.4 小结

第3章 基于芘激发态二聚体和杂交链式放大技术的荧光核酸探针用于生物溶液中DNA的高灵敏检测

3.1 前言

3.2 实验部分

3.2.1 试剂与仪器

3.2.2 芘-DNA-芘分子的合成与纯化

3.2.3 杂交链式放大技术检测DNA的条件

3.2.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳

3.2.5 芘分子二聚体的荧光寿命检测

3.2.6 方法的选择性考察

3.3 结果与讨论

3.3.1 实验原理

3.3.2 芘分子标记位置的选择

3.3.3 对杂交链式反应的凝胶电泳分析

3.3.4 对杂交链式反应的荧光分析

3.3.5 在缓冲溶液中对目标DNA进行定量分析

3.3.6 在缓冲溶液中的选择性分析

3.3.7 在复杂生物溶液中对目标DNA的检测

3.4 小结

第4章 基于芘激发态二聚体和竞争反应的荧光核酸适体探针用于人血清中溶菌酶的高灵敏检测

4.1 前言

4.2 实验部分

4.2.1 试剂与仪器

4.2.2 双标芘探针的合成与纯化

4.2.3 检测条件

4.2.4 荧光检测

4.2.5 热力学与动力学研究

4.2.6 选择性实验

4.2.7 人血清样品的处理

4.3 结果与讨论

4.3.1 实验原理

4.3.2 发夹型探针的设计

4.3.3 热力学研究

4.3.4 动力学研究

4.3.5 在缓冲溶液中对溶菌酶进行检测

4.3.6 选择性分析

4.3.7 在人血清中对溶菌酶进行检测

4.3.8 方法的通用性研究

4.4 小结

第5章 基于分子信标和缺刻酶信号放大技术的核酸适体探针用于人白血病细胞的高灵敏检测

5.1 前言

5.2 实验部分

5.2.1 试剂与仪器

5.2.2 分子信标DNA探针的合成与纯化

5.2.3 分子信标DNA探针和缺刻酶性能的测试

5.2.4 细胞培养

5.2.5 核酸适体与细胞结合能力的测试

5.2.6 对细胞检测的条件与流程

5.3 结果与讨论

5.3.1 基本原理

5.3.2 缺刻酶在分子信标上的性能考察

5.3.3 核酸适体与细胞结合能力考察

5.3.4 对Ramos细胞的定量检测

5.3.5 特异性考察

5.4 小结

第6章 基于人血管生成素的核酸适体探针用于增强光动力学治疗效果的研究

6.1 前言

6.2 实验部分

6.2.1 试剂与仪器

6.2.2 核酸适体-光敏剂交联物的合成与纯化

6.2.3 缓冲溶液的配制

6.2.4 核酸适体-光敏剂交联物与血管生成素结合的条件

6.2.5 细胞培养及靶向识别研究

6.2.6 光动力学治疗后的细胞毒性研究

6.3 结果与讨论

6.3.1 实验设计及工作原理

6.3.2 核酸适体-光敏剂交联物的表征

6.3.3 探针对靶细胞的选择性结合

6.3.4 探针Apt-ce6-ang在目标细胞MCF-7上的内化

6.3.5 光动力学治疗后的细胞毒性实验分析

6.4 小结

结论

参考文献

附录A 攻读学位期间发表的学术论文目录

致谢