拟南芥ABA信号转导途径中ROP10上游激活子RopGEFs基因的筛选

摘要

小G蛋白ROP(Rho-related GTPase from plants)作为植物生长发育过程中重要的“分子开关”，参与调控多种信号转导过程。研究表明，ROPs蛋白家族成员ROP10在ABA信号途径中能负调控ABA诱导的如气孔关闭，根伸长及种子萌发等反应。近来发现拟南芥鸟苷酸交换因子(guanine nucleotide exchange factor，GEF)是ROP的调控蛋白，它能催化GTPase，使之由GDP结合的失活状态(GDP-GTPase)转变成GTP结合的活化状态(GTP-GTPase)。作为小G蛋白ROPs的上游调控子，RopGEFs在植物生长发育以及胁迫作用下的功能还不太清楚。
　　课题组前期对RopGEFs家族T-DNA插入突变体进行了鉴定，筛选出7个纯合子突变体。本工作采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)方法对缺失突变体中相应的RopGEF基因的表达水平进行分析，验证了这7个ropgefs确实为T-DNA插入的纯合突变体。接下来，我们以不同浓度ABA处理拟南芥ropgefs突变体和野生型幼苗，分析ROP10和MYB2的转录表达水平，发现ropgef12和13中的ROP10表达水平比野生型Co1-0的低，且表达受ABA的浓度影响较小；ropgef4、11和14中ROP10表达受ABA的浓度影响较大，而ropgef14的表达谱与Co1-0一致。在1和50μM浓度ABA处理下，ropgef12和13的MYB2表达与ROP10的T-DNA缺失突变体相似，而ropgef4、11和14中MYB2的表达却不同。
　　比较各个ropgefs突变体和野生型的种子萌发率、根长和幼苗失水率等表型发现发现ropgef4、11、12和13对ABA的胁迫应答与Co1-0差异不显著，ropgef14表型与Co1-0基本一致。结合基因表达和表型分析，本论文认为RopGEF12和13可能调控ROP10介导的ABA信号途径，而RopGEF14不独立参与该信号转导途径，同时我们分析RopGEFs之间存在功能冗余。以上结论为进一步研究RopGEFs家族功能以及ABA信号转导的调控机制提供了一定的依据。

目录

文摘

英文文摘

缩略词

第1章 绪论

1.1 脱落酸与植物信号转导

1.1.1 脱落酸的发现、合成和分布

1.1.2 脱落酸的代谢

1.1.3 脱落酸的作用机制

1.1.4 ABA的生理功能

1.1.5 ABA信号转导途径

1.2 G蛋白与信号转导系统

1.2.1 G蛋白概述

1.2.2 G蛋白与信号传递

1.3 小G蛋白与信号转导途径

1.3.1 小G蛋白概述

1.3.2 小G蛋白的结构与调节机制

1.3.3 ROP蛋白与ABA的信号转导

1.4 拟南芥RoPGEFs蛋白家族与ABA信号转导

1.4.1 RopGEFs蛋白概述

1.4.2 RopGEFs蛋白家族与ABA的信号转导

1.5 本论文研究目的、意义与内容

第2章 拟南芥部分rogefs缺失突变体的鉴定

2.1 实验材料、试剂与仪器

2.1.1 实验材料

2.1.2 主要试剂

2.1.3 实验溶液配置

2.1.4 实验仪器

2.2 实验方法

2.2.1 拟南芥材料的处理

2.2.2 拟南芥花RNA的提取和逆转录反应

2.2.3 cDNA模板的检测

2.2.4 实时荧光定量PCR原理概述

2.2.5 引物的合成与设计

2.2.6 Real-time PCR检测方法

2.3 结果与分析

2.3.1 拟南芥RopGEF基因T-DNA插入突变体的Q-PCR鉴定

2.3.2 拟南芥ropgefs突变体的T-DNA插入位点分析

2.4 小结

第3章 拟南芥部分ropgefs缺失突变体中ROP10与MYB2的基因表达

3.1 实验材料、试剂与仪器

3.1.1 实验材料

3.1.2 主要试剂

3.1.2 实验溶液配制

3.1.3 实验仪器

3.2 实验方法

3.2.1 拟南芥材料的处理与收集

3.2.2 拟南芥幼苗总RNA的提取和逆转录反应

3.2.3 cDNA模板的检测

3.2.4 Real-time PCR检测方法

3.3 实验结果及分析

3.3.1 不同浓度ABA处理下ropgefs突变体中ROP10的表达水平

3.3.2 不同浓度ABA处理后ropgefs突变体中MYB2的表达水平

3.4 小结

第4章 拟南芥部分ropgefe缺失突变体的表型研究

4.1 实验材料、仪器及试剂

4.1.1 实验材料

4.1.2 实验溶液配置

4.1.3 其他试剂

4.1.4 实验仪器

4.2 实验方法

4.2.1 种子的处理

4.2.2 拟南芥野生型与ropgefs缺失突变体的表型实验

4.3 实验结果与分析

4.3.1 拟南芥野生型和ropgefs突变体种子萌发率的分析

4.3.2 拟南芥ropgefs缺失突变体和野生型的根长比较分析

4.3.3 拟南芥ropgefs缺失突变体和野生型的持水率分析

4.4 小结

结论

参考文献

附录 攻读硕士学位期间所发表学术论文的目录

致谢