香豆素类OCl-/CN-/Cys比率荧光探针的合成及光谱性能研究

摘要

比率荧光探针所具有的多种优点使其在80年代以来得到了迅速发展，它采用的比率法测量技术克服了以往单波长探针的一些缺陷，如单波长探测量的数据是单一波长处的荧光强度，而荧光强度易受外部环境(如温度)、样品本身(如浓度)、仪器条件(如光散射、光漂白、背景光)等因素的影响，需要严格控制实验条件才能得到较准确的结果。所以在本文中设计的主要是比率荧光探针，并将其应用效果做了初步检测。
　　本文分别介绍了设计比率荧光探针时常用的的几种机理，荧光共振能量转移(FRET)、分子内电荷转移(ICT)、光诱导电子转移(PET)、激基缔合物(Monomer-Excimer)的形成或消失、激发态分子内质子转移(ESIPT)等，本文中探针依据的检测原理主要是ICT机理，荧光团部分采用香豆素类化合物。
　　首先设计了用来检测OCl-的比率荧光探针1b。目前已报道的OCl-探针主要是单波长探针和我们实验室之前设计的一个比率型探针，但该探针的pH应用范围为9.0，不适用于生物体内应用。新设计的探针1b的pH应用范围是在6.0～9.0，适合物生物体内应用，且在这个范围内其选择性和竞争性效果很好；通过对响应后的产物结构的表征，我们证明了探针是被还原成了醛；细胞比率成像的效果也很明显，达到我们的预期目的。其次设计的CN-探针是一个结构简单、容易制备但检测效果很好的比率型探针，它和以往的探针相比，最大优点在于检测限低、动力学范围宽、响应迅速，且检测过程不受体内其它阴离子等的影响；通过密度泛函理论(DFT)得到探针的最优结构，并计算出最可能的反应位点；根据质谱、氢谱对反应过程的实时监测，推测响应机理并表征了响应产物的结构。最后设计的半胱氨酸探针Ratio-Cys是第一个可以将半胱氨酸和高半胱氨酸、谷胱甘肽鉴别开来的比率型荧光探针。光谱实验主要研究了反应的动力学过程，得到的二级动力学常数表明Ratio-Cys和半胱氨酸的反应比高半胱氨酸、谷胱甘肽要快得多且能够反应完全，这也可能是探针能够选择性检测半胱氨酸的根本原因；另外又通过质谱对反应过程的监测证明了该反应过程可能是先根据Baldwin规则生成一个七元成环中间体，再与另一分子的半胱氨酸发生加成反应，这同时也解释了为什么探针对高半胱氨酸、谷胱甘肽的响应迟缓且反应不完全；探针与半胱氨酸反应后荧光波长显著移动，可以用于细胞中半胱氨酸的比率成像。

目录

文摘

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论文基本信息

授权书

第1章 绪论

1.1 引言

1.2 香豆素类化合物

1.3 比率荧光探针设计的基本原理

1.3.1 荧光共振能量转移机理(FRET)

1.3.2 激发态分子内质子转移机理(ESIPT)

1.3.3 分子内电荷转移机理(ICT)

1.3.4 单体/激基缔合物(mono/excimer)机理

1.4 光诱导电子转移机理(PET)引起的荧光淬灭现象

1.5 本课题的研究内容

第2章 基于香豆素的次氯酸比率荧光探针

2.1 前言

2.2 目标产物及其中间体的合成和表征

2.2.1 合成路线

2.2.2 仪器与试剂

2.2.3 实验部分

2.3 目标化合物及中间体的设计与合成中的问题讨论

2.4 光谱性能研究

2.4.1 仪器与试剂

2.4.2 测试溶液的配制

2.4.3 光谱的测定

2.5 细胞实验

2.6 小结

第3章 基于香豆素的CN-比值荧光探针

3.1 前言

3.2 合成路线

3.3 中间体和目标产物的合成

3.3.1 仪器与试剂

3.3.2 探针和控制物的合成及表征．

3.3.3 合成过程讨论

3.4 光谱性能研究

3.4.1 探针和控制物的吸收及发射光谱分析

3.4.2 滴定实验

3.4.3 时间曲线

3.4.4 选择性和竞争性实验

3.4.5 响应机理的研究及产物结构的确定

3.5 小结

第4章 基于香豆素的半胱氨酸比值荧光探针

4.1 前言．

4.2 化合物Ratio-Cys的合成

4.2.1 仪器与试剂

4.2.2 实验部分

4.3 光谱性能研究

4.3.1 PBS缓冲溶液的配制

4.3.2 Ratio-Cys母液的配制

4.3.3 测定试液的配制

4.3.4 Ratio-Cys的光谱性质研究

4.4 小结

结论

参考文献

附录A 攻读学位期间所发表的学术论文目录

附录B 合成化合物一览图

附录C 部分化合物的谱图

致谢