纳米材料信号增强电化学/电化学发光检测蛋白激酶

摘要

蛋白质磷酸化在新陈代谢、细胞信号通讯、细胞增殖与分化等生命活动中起着非常重要的作用。据统计，有高达30％的人类蛋白要经过蛋白激酶的修饰，从而调节细胞的生理生化功能。而异常的蛋白质磷酸化与许多疾病密切相关，如许多慢性炎症性疾病、癌症、糖尿病和老年性痴呆等。因此，了解蛋白激酶的作用机理并找出有潜在功能的抑制剂，对疾病的诊断、治疗和药物的研发具有非常重要的指导意义。传统的蛋白激酶活性检测方法有很多，尽管这些方法很有效，但大多具有操作复杂、灵敏度不高、需放射性标记、需昂贵仪器等缺点，所以发展新的蛋白激酶活性分析方法是十分必要的。电化学和电化学发光生物传感器具有装置简单、灵敏度高、选择性好等特点而受到研究者们的广泛关注。特别是随着纳米技术的发展，各种功能化纳米材料被逐渐引入电化学及电化学发光生物传感器的构建。由于纳米材料本身所具备的小尺寸效应、大比表面积、良好的生物相容性和表面易修饰等优良特性，尤其是在检测DNA、蛋白质、小分子等方面所表现出的信号增强效应，为电化学及电化学发光生物传感器性能的进一步改善和优化带来了新契机。基于此，本论文以发展蛋白激酶分析新方法为目标，利用纳米材料信号增强作用，构建新型电化学和电化学发光生物传感器，开展了蛋白激酶活性及其抑制剂相关研究，主要包括以下两个方面的工作：
　　一、基于TiO2/MWNTs纳米复合物免标记电化学检测酪蛋白激酶2活性
　　利用TiO2/MWNTs纳米复合物发展了一种免标记分析酪蛋白激酶2(CK2)活性以及相关抑制剂的电化学方法。该方法利用TiO2纳米颗粒能特异性结合磷酸基团和MWNTs能加快电子传递速率的特性来实现CK2活性的灵敏检测。首先将合成的TiO2/MWNTs纳米复合物修饰在玻碳电极表面，其中MWNTs既可以增加电极的比表面积，还可以加速电子传递。在ATP存在的条件下，CK2催化底物肽磷酸化，将磷酸基团转移到底物肽的丝氨酸残基上。由于磷酸基团能与TiO2纳米颗粒特异性结合，使磷酸化的底物肽结合到被TiO2/MWNTs纳米复合物质修饰的玻碳电极表面，形成肽绝缘层。在电极表面形成的肽绝缘层使氧化还原探针[Fe(CN)6]3-/4-不易靠近电极表面从而使峰电流下降，下降的峰电流大小与CK2浓度成响应关系，这提供了一种新型传感策略来监控底物肽的磷酸化。该设计能实现CK2活性的免标记分析，得到的检测限为0.07U/mL，线性响应浓度范围为0 U/mL～0.5 U/mL。同时，该方法还被用于对CK2的抑制实验和干扰实验研究。
　　二、基于磷酸化联吡啶钌二氧化硅纳米颗粒信号增强电化学发光检测蛋白激酶A活性
　　结合磷酸化联吡啶钌二氧化硅纳米颗粒(Rubpy-PSiNPs)的信号产生和增强作用，发展了一种免标记且高灵敏分析蛋白激酶A(PKA)活性和抑制剂的电化学发光方法。首先通过溶胶-凝胶法合成了Rubpy-PSiNPs。当ATP存在时，修饰在金电极上的底物肽经PKA催化将磷酸基团引入到底物肽的丝氨酸残基上。由于Zr4+能与两个磷酸基团共价结合，从而介导磷酸化底物肽与Rubpy-PSiNPs之间的连接，使Rubpy-PSiNPs结合到金电极表面，产生强的电化学发光响应，响应强度与PKA浓度正相关，这提供了一种分析底物肽磷酸化的传感新策略。该方法能实现对PKA活性高灵敏地分析，得到的检测限为0.005 U/mL，线性浓度响应范围为0.01 U/mL～1 U/mL。同时，该方法还可用于对PKA的抑制实验和干扰实验研究。

目录

文摘

英文文摘

本文常用英文缩略词表

第1章 绪 论

1.1 蛋白激酶的生物学意义及传统检测方法

1.1.1 蛋白激酶的生物学意义

1.1.2 蛋白激酶的传统检测方法

1.2 电化学生物传感器

1.2.1 电化学生物传感器概述

1.2.2 电化学生物传感器的分类

1.2.3 电化学检测蛋白激酶活性

1.3 电化学发光生物传感器

1.3.1 电化学发光生物传感器概述

1.3.2 电化学发光生物传感器的分类

1.3.3 电化学发光检测蛋白激酶活性

1.4 纳米材料及其在电化学和电化学发光生物传感器中的应用

1.4.1 纳米材料的特性

1.4.2 纳米材料在电化学和电化学发光生物传感器中的应用

1.5 本论文的工作设想

第2章 基于TIO2/MWNTS纳米复合物免标记电化学检测酪蛋白激酶2活性

2.1 前言

2.2 实验部分

2.2.1 试剂和材料

2.2.2 TiO2/MWNTs纳米复合物的合成

2.2.3 TiO2/MWNTs纳米复合物修饰玻碳电极的构建

2.2.4 CK2活性的电化学检测

2.2.5 干扰实验的考察

2.2.6 抑制剂对CK2活性影响的考察

2.2.7 稳定性的考察

2.3 结果与讨论

2.3.1 实验原理

2.3.2 TiO2/MWNTs纳米复合物的表征

2.3.3 电极修饰过程的阻抗表征

2.3.4 实验可行性的验证

2.3.5 实验条件的优化

2.3.6 CK2活性的分析

2.3.7 干扰实验的考察

2.3.8 抑制剂的影响

2.3.9 稳定性的研究

2.4 小结

第3章 基于磷酸化联吡啶钌二氧化硅纳米颗粒信号增强电化学发光检测蛋白激酶A活性

3.1 前言

3.2 实验部分

3.2.1 试剂和材料

3.2.2 磷酸化联吡啶钌二氧化硅纳米颗粒的制备

3.2.3 工作电极的修饰

3.2.4 电化学发光分析PKA活性

3.2.5 干扰实验的考察

3.2.6 抑制剂对PKA活性影响的考察

3.3 结果与讨论

3.3.1 实验原理

3.3.2 磷酸化联吡啶钌二氧化硅纳米颗粒的表征

3.3.3 电极修饰过程的阻抗表征

3.3.4 实验可行性的验证

3.3.5 实验条件的优化

3.3.6 PKA活性的分析

3.3.7 干扰实验的考察

3.3.8 抑制剂的影响

3.4 小结

结论

参考文献

致谢

附录 攻读硕士学位期间主要完成的学术论文