基于酶活性及小分子分析的核酸生物传感器研究

摘要

生物传感器作为近期分析化学非常重要的课题之一，已经得到了空前的发展，并且应用范围特别广泛，特别是核酸生物传感器，已经成为近几年大量学者的研究热点。核酸生物传感器是利用DNA分子之间互补配对的特异性，以核酸作为分子识别元件，将反应产物转变为电、光、声等可识别的信号，实现对特定核酸序列进行分析的传感器。由于其具有简便快速、灵敏度较高、稳定性强、成本较低的特点，广泛应用于临床医学诊断、食品检验、环境监测等领域。
　　酶是一种生物催化剂，支配着生物的新陈代谢、营养和能量转换等过程。生物的生长发育、繁殖、遗传、运动、神经传导等生命活动与酶催化过程密切相关，大多数广泛存在于组织细胞、红细胞、血浆中，与细胞损伤、缺氧、中毒、衰老、多种疾病的发生有关。尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)是一种高度可保留损伤修复蛋白，广泛存在于真核细胞及原核生物细胞当中，是一种能保持基因完整及防止基因突变的重要酶之一。该酶能产生尿嘧啶清除修复碱基对，该碱基对能清除人体中因各种因素产生的DNA尿嘧啶残基，在异常碱基修复过程中起到关键性的作用。近几十年来，尿嘧啶清除过程的研究得到了越来越多的关注，不仅探索研究DNA-UDG相互作用机理，同时还直接测定UDG酶的活性，这在生物学上具有重大的意义。另外，小分子化合物能通过非共价结合、氢键、离子键、范德华力、疏水键等作用方式与DNA较好地结合，通过这一原理建立新颖的分析检测方法，可以解决越来越被重视的食品安全问题，成为理论解决实际问题的突破之一。本研究论文主要建立了几种能简便、快速、灵敏检测酶活性及小分子的核酸生物传感器，具体内容如下：
　　(1)建立了一种花费小、快速、灵敏、简便的分析检测UDG酶活性的核酸生物传感器。该传感器是基于核酸荧光染料SYBR Green I与双链DNA结合后荧光强度大大增加的特性，设计了发夹型DNA链，并结合UDG酶催化反应机理，当体系中存在UDG酶时，DNA链的U碱基会被切除，发夹型DNA链被破坏，体系中SYBR Green I荧光信号会变弱。在200 nM DNA、5×SG及15 U/mLEndoⅣ的条件下，于1×NEBuffer3(5 mM Tris-HCl，10 mM NaCl，1 mM MgCl2，0.1 mM Dithiothreitol，pH7.9)缓冲溶液体系中，随着UDG酶浓度增加，SYBRGreen I荧光强度减弱，建立了UDG酶工作曲线，检测下限达到0.05 U/mL，尤其是UDG酶浓度为0.05 U/mL-3 U/mL之间时，SYBR Green I的荧光值变化趋势特别明显，两者具有很好的线性关系，线性回归方程为Y=-1562.9X+8190.2(r2=0.992)，为UDG酶活性检测开辟了新的方法。
　　(2)建立了一种利用比色分析检测UDG酶活性的核酸生物传感器。该传感器是依据纳米金制备过程简单、稳定性强、粒径均一、导电性高、生物相容性好、具有独特的光学效应等优点，并借助于纳米金团聚产生明显波长及吸光度的变化，实现对UDG酶活性的检测及其抑制剂的研究。通过对传感器的工作条件进行优化分析，在50 nM双链DNA、25 U/mL EndoⅣ、5μL DNA1-AuNPs和DNA2-AuNPs条件下，于25 mM Tris-HCl，50 mM NaCl，5 mM MgCl2，0.5 mMEDTA缓冲溶液(pH7.9)体系中，随着UDG酶浓度增加，体系的吸光度值降低，吸收波长发生红移。而且吸光度值与UDG酶浓度具有较好的线性关系，线性回归方程为Y=-0.024X+0.642(r2=0.997)，检测下限为1 U/mL。该传感器方法较新颖、灵敏度较高，拓展了UDG酶活性检测的另一种新方法。
　　(3)建立了检测三聚氰胺的核酸生物传感器。该传感器基于核酸染料SYBRGreen I荧光信号对单、双链DNA的不同表现和石墨烯氧化物对单、双链DNA的不同作用方式，以及三聚氰胺能诱导聚胸腺嘧啶(T)核酸链形成T-Melamine-T折叠构型的原理，通过检测SYBR Green I的荧光值，实现对三聚氰胺的快速检测。当体系中仅存在聚T链、石墨烯氧化物和SYBR Green I时，SYBR Green I的荧光信号几乎没有，而当体系中加入三聚氰胺后，形成的T-Melamine-T折叠构型使得SYBR Green I的荧光信号大大增强，随着三聚氰胺浓度的不断增加，SYBR Green I的荧光值呈现快速增加，检测下限达nM级。达到了快速、灵敏、低成本检测三聚氰胺的目的。

目录

文摘

英文文摘

第1章 绪 论

1.1 生物传感器的概述

1.1.1 生物传感器的工作原理

1.1.2 生物传感器的特点

1.1.3 生物传感器的分类

1.2 核酸生物传感器

1.2.1 核酸生物传感器的主要研究方向

1.2.2 核酸生物传感器的分类

1.2.3 电化学DNA生物传感器

1.2.4 荧光DNA生物传感器

1.2.5 DNA生物传感器的应用

1.3 均相核酸传感器中纳米材料的应用

1.3.1 纳米材料的分类

1.3.2 纳米材料的应用

1.4 本课题的研究意义及研究内容

1.4.1 本课题的研究背景及研究意义

1.4.2 本课题的研究内容

第2章 基于SYBR Green I检测UDG酶活性

2.1 前言

2.2 实验部分

2.2.1 实验试剂

2.2.2 实验仪器

2.2.3 DNA的杂交

2.2.4 DNA浓度的优化

2.2.5 SG浓度的优化

2.2.6 Endo IV浓度的优化

2.2.7 UDG、Endo IV及UGI的作用原理的验证

2.2.8 UDG酶活性检测

2.3 结果与讨论

2.3.1 DNA序列的设计

2.3.2 DNA浓度的优化

2.3.3 SG浓度的优化

2.3.4 Endo IV浓度的优化

2.3.5 UDG、Endo IV及UGI的作用原理的验证

2.3.6 UDG的活性检测

2.4 小结

第3章 基于纳米金变色检测UDG酶活性

3.1 前言

3.2 实验部分

3.2.1 实验试剂

3.2.2 实验仪器

3.2.3 金纳米颗粒的合成

3.2.4 DNA修饰纳米金颗粒(DNA-AuNPs)的合成

3.2.5 双链DNA的合成

3.2.6 目标DNA浓度的优化

3.2.7 UDG酶催化反应时间的考察

3.2.8 UDG、Endo IV及UGI的作用原理的验证

3.2.9 UDG酶活性检测

3.2.10 光谱测量和动态光散射(Dynamic Light Scattering，DLS)测量

3.3 结果与讨论

3.3.1 传感器设计的原理

3.3.2 目标DNA浓度的优化

3.3.3 UDG酶催化反应时间的考察

3.3.4 UDG、Endo IV及UGI作用原理的验证

3.3.5 UDG酶活性检测

3.3.6 动态光散射验证UDG、Endo IV、UGI的作用机理

3.4 小结

第4章 基于SYB Green I信号变化检测三聚氰胺

4.1 前言

4.2 实验部分

4.2.1 实验试剂

4.2.2 实验仪器

4.2.3 石墨烯氧化物(GO)的制备

4.2.4 传感器的特异性验证

4.2.5 三聚氰胺检测过程

4.3 结果与讨论

4.3.1 原理

4.3.2 传感器的特异性验证

4.3.3 三聚氰胺检测结果

4.4 小结

结论与展望

参考文献

附录A 攻读硕士学位期间所发表的学术论文目录

致 谢